凝固酶阴性葡萄球菌的.ppt

凝固酶阴性葡萄球菌 致病性分子标志物的建立与应用 姜美娟 中国人民解放军第401医院 ;1、立题依据;近年来由于介入性诊疗操作、免疫抑制剂及广谱抗生素的广泛使用，CoNS已成为院内感染的重要病原菌，而且耐药菌株比金黄色葡萄球菌更为多见。 叶联华等报道人工瓣膜术后心内膜炎中，约有40%-50%由凝固酶阴性葡萄球菌引起； 2009年中国CHINET细菌耐药监测结果MRCoNS检出率平均为71.7%,大于MRSA的52.7%。 ;CoNS 作为皮肤黏膜定植菌，在越来越多的标本中被分离出来，常常引起临床困惑。其是否能作为感染的病原菌是临床关心的问题。 有鉴于此，实验室建立对CoNS污染菌和致病菌界定的方法十分必要，是临床明确诊断和制定合理治疗方案的重要前提 。 ;CoNS致病物质;ica 基因结构;获得CoNS特异的致病性分子标志物； 确立敏感、准确、快速的医院感染相关性CoNS特异基因诊断方法； 能够准确鉴定致病性与非致病性CoNS。 ; 研究CoNS的生物标志物对该菌在医院获得性感染中的临床微生物学诊断与鉴定，追踪传染源，探索其在医院感染中的确切作用和地位、传播与感染规律，从而对控制传播途径、建立准确有效的防治措施具有重要实际意义和经济价值。 ;阴性对照：表皮葡萄球菌ATCC12228，购自中国药品鉴定所，经基因组测序证明其ica操纵子缺失 ； 阳性对照：表皮葡萄球菌1-97-337，瑞金医院倪语星教授惠赠，含有完整ica操纵子； 待测样本：自2006年1月至2007年9月，收集我院临床各科室共114例疑是感染性标本。;2、主要试剂;3、主要仪器设备;4、实验设计及方法;图2.1： 部分样品刚果红试验结果;表2.1: 114例CoNS的菌种组成及刚果红试验结果;刚果红试验通过培养48h后菌落的颜色变化来反映 CoNS 表达多糖胞间黏附素的情况，进而间接地反映其致病性。 114例样品中刚果红试验阳性率21.1%，由于CoNS分泌的PIA在培养过程中可以丢失，使阳性结果偏低；另外，其方法学本身易于受多种因素影响，比如：蔗糖的浓度、氯化钠和琼脂的浓度、气体条件等，干扰了实验结果的正确性，不能满足临床要求。 ;2、ica D基因片段的扩增 ;表2.2: 114例CoNS不同菌种icaD片段PCR扩增的结果 ;通过设计icaD基因的特异性引物，对临床分离的114 株CoNS进行PCR 循环扩增，29%（33/114）的菌株可以检测到357bp 的icaD 基因产物； 表明大部分 CoNS 不表达胞外多糖，无致病性，或者临床分离的绝大部分 CoNS 可能是低毒性，源于正常菌群的污染。 采用 PCR 技术对 ica 操纵子结构基因片段进行扩增，可以准确、快速地鉴定CoNS中致病性与非致病性的葡萄球菌，从而对临床凝固酶阴性葡萄球菌的正确诊断和合理治疗提供实验室依据，有重要的临床意义。;图2.3 : 部分样品的定性黏附性实验结果; ;通过体外半定量黏附实验测得88.9%（8/9）icaD（ + ）菌株是粘附株。 可见以半定量黏附试验结果作为生物膜形成能力的判定标准，ica 操纵子的存在与CoNS粘附及其生物膜形成密切相关。 体外黏附性实验用光吸收原理检测生物膜成分，但生物膜本身的结构会受到破坏；且由于方法比较复杂，需要严格控制实验条件才能获得较好的重复性，不适合临床常规应用。 ;4、16S rDNA及sodA基因片段扩增; 图2.6： 部分样品的sodA 片段PCR 扩增结果;图7： 部分样品sodA PCR扩增产物的测序图谱; 37例CoNS样品进行了16S rDNA基因及sodA基因片段的PCR扩增，电泳检测结果显示全部样品均能准确地扩增出相应的片段，其片段大小分别为16S rDNA 926bp及sodA 482bp，且均为单一条带； 序列测定表明所有样品16S rDNA 及sod A PCR产物序列均相同，未发现与感染相关的特异性分子序列。 ;ica操纵子可出现在多种CoNS中，临床实验室建立并常规进行CoNS致病性分子标志物的检测方法是有意义、有必要的； 通过本实验我们确立了的敏感、准确、快速的医院感染相关性CoNS基因诊断新方法，即ica D基因扩增方法； ;结论;结论;谢谢！