原位PCR技术的.ppt

原位PCR技术 ; 原位PCR技术是一项极为敏感的原位显示、检测生命话性物质DNA或mRNA的示踪染色方法，它是核酸扩增与原位核酸杂交相结合的产物。特点是特异、灵敏、原位，检测阈值低，能达pg和fg水平，甚至可检出单拷贝的核酸序列。; 此项技术的基础是原位杂交技术（第八章）和液相PCR技术，前者是指应用标记的探针检测细胞内RNA、DNA的原位示踪染色技术，它比PCR技术更早应用于石蜡切片、冰冻切片、细胞等内源性或外源性DNA、RNA的检测。 ; 原位杂交技术的优点是组织形态保存好，特异性较高，成本低，不需特殊仪器。缺点是敏感性较低，但可通过改变检测手段的敏感性，或经原位核酸扩增后再行标记探针检测（间接原位PCR法）来提高检测效率。; 近年来，随着现代工业和分子生物学技术的飞速进步，核酸水平的原位检测方法也同样得到了长足发展，新技术、新方法层???不穷，除原位杂交和原位PCR外，又出现诸如：荧光原位杂交（FISH）；寡核苷酸引物原位DNA合成技术（PRIN）和比较基因组杂交技术（CGH）——第九章； ; 组织和细胞芯片技术（又叫微阵列技术（microarray technology）——第十一章；等等。限于时间，本次课只讨论第十章“ 原位PCR”技术，因为它多用，又与其它新方法有关联。其它章节内容，仅供同学们选用时参考。 ; 根据实验设计，原位PCR可分为直接法、间接法、原位反转录、原位再生或序列复制反应等类型。 ;第一节 原位PCR技术操作 ; 载盖玻片的清洁和组织切片的预处理，包括防脱片、蛋白酶消化等，基本上与原位杂交法类同。 ; 配制0.05%/0.01 mol/L Tris-Hcl，pH8.0多聚赖氨酸，每10ml 0.05%多聚赖氨酸中加入1μl TritonX-100,可保存于4℃，出现浑浊则不能使用。; 清洁的玻片置上述液体中20min，室温，然后60℃ 1h，玻片于室温中可保存1个月备用。; 处理的玻片上加1～2滴aqueous胶，组织敷贴其上，45℃加热，再将切片烤干60℃ 90min，冷却20℃，24h，室温保存。;最后以0.1mol/L Tris-Hcl,pH7.4洗5min。 ; 溶解蛋白酶K于0.1mol/L Tris-Hcl, pH8.0/10mmol/L EDTA（蛋白酶K浓度：组织片为10μg/ml，细胞片为20μg/ml），消化时间依蛋白酶浓度，不同组织而异，一般为20min。消化结束后95℃，2min灭活蛋白酶，0.1mol/L Tris-Hcl, pH7.4洗。;二、原位PCR技术类型及其操作原理 （一）直接原位PCR 图10-1 （二）间接原位PCR 和 （三）原位RT-PCR 图示 ;图10-1 直接法原位PCR示意图 ;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.; 原位RT-PCR为结合反转录反应和PCR扩增检测细胞内低拷贝mRNA的方法，首先以RNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA，再以合成的cDNA为模板进行PCR扩增。 ; 原位RT-PCR反应过程在固定的组织细胞标本上进行，进行原位RT-PCR的标本先要用DNA酶处理，以破坏组织细胞中的DNA，保证PCR扩增的模板是从mRNA反转录合成的cDNA而不是细胞中原有的DNA。如果PCR扩增的引物与细胞本身的基因DNA相距甚远，可不必用DNA酶处理。; 1991年Cetus公司推出了一种新酶，rTth逆转录酶，其特点是具有很强的分别依赖RNA和DNA的耐热DNA聚合酶活性，利用rTth酶，可使原位RT-PCR上述的两个步骤，用一种酶，一个条件下完成，简化了步骤，缩短了时间。; （四）原位再生或序列复制反应（3SR） 用于检测组织细胞原位扩增RNA的一项新技术，其不同于原位RT-PCR的重要特点是：①扩增反应液成分有差异。内含有; 3SR酶液，即AMV逆转录酶、大肠杆菌RNA酶H和T7RNA聚合酶，加入的引物5‘端带有T7RNA聚合酶启动子序列；②扩增反应在低温（42゜c）下进行，不需热循环；③一步到位，扩增反应后，杂交显示观察。 ; 上述各种方法类型的检测显示系统，可以是同位素（32P、35S等）——通过放射自显影加以显示；也可以是非同位素（如生物素、地高辛等）——通过免疫组化染色加以显示。 图10-3，图10-4;图10-3 卵白素-生物素检测系统 ;图10-4 地高辛精系统检测原位