染色体荧光原位杂交技术剖析.ppt

定位一个克隆片段在染色体上的位置的另外一个方法是探针与杂交细胞株系列(Somatic cell hybird Panel)进行杂交，因为各个细胞株所含的人染色体区段不同，杂交结果就可以说明克隆片段在染色体上的位置。研究结果表明FISH定位的结果和杂交细胞株系列的结果一致。在今日，FISH技术日趋成熟，精度越来越高的情况下，使用杂交系细胞株系列定位的人越来越少了。 FISH技术的其它应用 1．细胞遗传学的研究 （1）实体肿瘤的染色体研究比较困难，这是由于获取足够量的分裂期肿瘤细胞比较困难。使用染色体着丝粒特异探针，对问期细胞进行染色体数量变异分析，可获得较好的结果”。 Fig. 2. Example of the SKY analysis of metaphase chromosomes prepared from the GRANTA-519 cell line. The RGB image (A) and the DAPI-stainedchromosomes (B) are shown. Identification of chromosomes and chromosomal alterations is possible after chromosome classification. Chromosomes inRGB (left) and classified colors (right) are shown in the lower panel. Fig. 3. Multicolor banding analysis of chromosome 1 revealed an inversion in 1p that was not detectable by conventional cytogenetic analysis and SKY. This is shown on the right in comparison with a normal chromosome 1 in a healthy person (left). The breakpoint in the inverted chromosome is indicated by an arrowhead. （2）选择按一定顺序排列的基因探针，可以帮助确定染色体倒位，尤其是臂间倒位的性质，如急性白血病有16号染色体的倒位。 2．基因图谱的绘制 （1）采用FISH技术，不仅可以直接确定某一DNA链在染色体上的位置．而且应用多种颜色荧光素标记探针，还提供了一个简单的确定基因顺序的方法。可用不同颜色荧光素标记两个不同的DNA链，而且他们在染色体上的距离大于1Mbp时，可以依据不同探针信号的排列关系分辨它们在染色体上的顺序。 （2） 标记同一DNA链与不同种属细胞的染色体杂交，可以找出不同种属之间的同源基因以及基因在染色体上的位置，从而了解种属之闯的进化关系。 3．基因扩增的检测 DNA扩增通常表现为异常的显带区域(ABRS)或异染色质区(HSRS)以及无着丝微小体(DM)，这些基因扩增的细胞遗传学表现出现在许多恶性肿瘤中。搞清楚肿瘤细胞中特定DNA链(基因)的扩增，有助于了解肿瘤的恶性增生过程。恶性增生过程。在肿瘤细胞中某些肿瘤基因(Oncogene)的扩增，可作为预测肿瘤进展及预后的临床指征。如乳腺癌细胞中Her／2一nell基因的扩增常预示着患者预后较差。 4．FISH技术的新进展 1993年9月，美国德克萨斯州癌症治疗和研究中心的Parra和Windle报道了迄今为止精度最高的FISH。这是一种新的作图方法，在这一技术中，双链DNA完全伸展并依附在载片上，与生物素或地谷新标记的探针杂交之后，用荧光抗生物素蛋白或其它抗体检测DNA探针在伸展的DNA链上的分布是可见的，并可以用荧光显微镜记录下来。从这一图象，可以作出一图谱，称为直视杂交DNA图谱(direct visual hybridization DNA Map，DIRVISH)。这一作图技术遵循这样一个原理，一个小的DNA区域(假定为5kb)，当它伸展到一定的长度时，这是可以在显微镜下看见的。基于这样的数据：对于完全伸展的双链DNA来讲，每对碱基所占的长度为0.34nm，那么5kb的DNA长度为1．7μm，一个40kb的cos质粒将占13．6Pμm，一个500kb的YAC将占据170μm。在制备载片时，先将细胞固定在载片的一端，然后用去污剂消化，让溶液中的DNA动态地流到另一端，就得到了伸展的DNA双链，结合常规FISH就可以得到DIRVISH图。这篇文章报道了他们在两天内做出的一个结果，一个跨度为200kb，含有五份拷贝的扩增的二氢叶酸还原酶