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第章 微生物药物产生菌
微生物制药 第1章 微生物药物的产生菌 药物的产生菌; 新药产生菌的分离; 新微生物药物的筛选。 1.1微生物药物的产生菌 主要包括放线菌、真细菌和丝状真菌等。 1、放线菌 应用于临床的微生物药物大部分来源于放线菌的次级代谢产物。 放线菌产生的抗菌药物中化学类别较多。 (1)放线菌产生的抗菌药物 β-内酰胺类 氨基糖苷类 大环内酯类 四环素类 紫霉素类 糖肽类 多烯类 其他抗细菌抗生素 产生β-内酰胺类抗生素的放线菌 产生氨基糖苷类抗生素的放线菌 产生多烯类抗生素的放线菌 产生其他抗细菌抗生素的放线菌 (2)放线菌产生的抗肿瘤药物 蒽环类抗生素产生菌 糖肽类抗生素产生菌 其他抗肿瘤抗生素 (3)其他药物产生菌 2、细菌 3、真菌 4、其他药物产生菌 2.分离微生物 样品的处理 分离培养基 抑制剂的使用 分离方法 培养条件 稀有放线菌的选择性分离 其他微生物的分离 (1)样品的处理 利用放线菌孢子和细菌营养细胞及不同属间放线菌孢子间的耐性差异,用物理或化学的方法除去细菌及目的外放线菌,或者用花粉作为诱饵,增加某些特定放线菌的分出率。 ①温度-分离前样品加热处理 ②化学试剂的处理 SDS-酵母膏处理法,SDS对放线菌孢子基本无害,酵母浸膏以及温和的热休克可以促进放线菌孢子的出芽,使细菌数明显减少。 风干的土壤与CaCO3混合后在26℃培养7~9 d,然后分离放线菌。风干的土壤减少了细菌的数量,CaCO3有利于放线菌生长而不利于绝大多数真菌的生长。 用0.01 mol/L NaOH处理土壤5~10 min(15℃)可减少细菌的数量,有利于分离小单孢菌。 用1.4%酚处理土样10 min或用1.4%酚130℃处理30 min,分别有利于获得链霉菌或小单孢菌。 用乙酸乙酯或氯仿和苯处理样品,过滤风干后用来分离微生物,可以除去样品中的真菌。 ③物理方法的处理 离心,1600 g离心20 min,上清液主要有放线菌孢子,沉淀含有细菌和真菌孢子。 超声波处理,分离小单孢菌和链霉菌。 特殊器具捕集空气中的游离孢子,分离糖多孢菌。 搅动,使干草上孢子脱落,用于从干草中分离高温放线菌。 膜过滤,将水经膜(孔径0.45um滤膜)过滤,浓缩水中微生物,再将膜直接贴在琼脂平板上培养。 诱饵法,在培养基中添加特殊物质,如花粉、蛇皮、头发等,可分离小瓶菌和发仙菌。 (2)分离培养基 总的要求:尽量使样品中的全部放线菌都生长出来,而其他微生物(细菌和真菌)又尽可能不长。 合成培养基——精氨酸培养基,高氏合成一号培养基,天门冬素培养基,察氏培养基等 有机培养基——Waksman培养基,Bennett培养基 几丁质培养基——只有放线菌能够利用几丁质,生长的菌落小,白色,需转接到产可溶性色素的适当培养基上加以区分 HV培养基——以土壤腐殖质为唯一碳源和氮源的培养基 选择性分离放线菌所使用的培养基 (3)抑制剂的使用 加入抗真菌试剂(制霉菌素、两性霉素B、放线菌酮、丙酸钠以及使真菌形成较小菌落的rose bengal等),抑制真菌生长; 加入抗细菌抗生素(青霉素、链霉素)抑制细菌生长,增加放线菌的分出率; 加入某些抗生素也可抑制部分放线菌,有利于分离到一定种类的放线菌。如新生霉素有利于分离北里孢菌属。 (4)分离方法 稀释法——最常用,将土壤样品用无菌水(或生理盐水、磷酸缓冲液)制成悬液,倍比稀释,涂布平板,恒温培养。 干土喷射法——用喷土机或其他方法将风干碾细的土样直接喷在分离平板上。 孢子飞扬法——将样品置于特制瓶中,其瓶口刚好能倒置一个分离平板,剧烈振荡使孢子飞扬,撞到分离平板上进行分离培养。 滤膜法——将0.22~0.45um的滤膜放在分离平板上,接种菌悬液或喷撒干土,适温培养一段时间,放线菌菌丝可穿过滤膜小孔生长到培养基上,细菌只能在滤膜表面生长,去掉滤膜,深入培养基的放线菌经继续培养后长出菌落。 (5)培养条件 一般培养温度为25~30℃,也有32~37℃,培养7~14 d,生长慢的放线菌可延长培养1个月; 分离高温放线菌用45~50℃培养1~2 d; 海水放线菌用20℃培养6周左右。 (6)稀有放线菌的选择性分离 稀有放线菌的特征: 生长速度比较缓慢; 营养需求较为复杂; 比较缺乏孢子分化的能力; 不能稳定保存。 分离几种稀有放线菌的方法 分离几种稀有放线菌的方法 分离几种稀有放线菌的方法 分离几种稀有放线菌的方法 分离几种稀有放线菌的方法 分离几种稀有放线菌的方法 其他微生物的分离 3.选留菌种及保存 将菌株的优良特性保存下来,保持微生物的活力。 低温保藏法 传代培养保藏法 液体石蜡保藏法 沙土保藏法 冷冻干燥保藏法 (二)海洋微生物的分离 Okami等从海洋中分离放线菌的程序 分离海洋放线菌的培养基 (1)SC培养基: (三)极端微
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