复方中药粗提物的分级与生物活性筛选.ppt

复方中药粗提物的分级和生物活性筛选 综合化学实验（化学生物学） 授课教师 闫素君 马林 Tel:cesyansj@mail.sysu.edu.cn 一、实验目的 了解复方中药美白原理 掌握中药粗提物的提取方法 传统/现代 理解并掌握提取物的分级方法和操作 萃取，减压柱层析 熟悉酶标仪的原理及使用 掌握酪氨酸酶活性测试方法、数据处理方法及表达 二、实验原理 将具有美白效果的复方中药的粗提物按极性大小进行分级，建立一个分级库后，进行酪氨酸酶活性筛选（还可以进行黑色素合成、增殖以及其它靶蛋白的筛选），从而系统性地研究中药复方的分子药理学，阐明其作用机制。 1. 提取方法—溶剂法：醇/水（70%） 2. 分级方法—减压柱层析：避免乳化，提高效率 3. 活性筛选—以邻苯二酚为底物，通过测试反应速率变化（反应体系的OD值变化）确定酪氨酸酶活性，从而确定各分级提取物对酪氨酸酶抑制活性的IC50 三、实验仪器和试剂 烧杯、砂芯漏斗、抽滤瓶、圆底烧瓶、锥形瓶、塑料样品管、96孔酶标板、刮铲、滴管等 旋转蒸发仪、水泵、移液枪、紫外-可见分光光度计、酶标仪 中药复方：甘草50g，白芷20g，土茯苓20g，川芎20g，丹皮10g，丹参10g，当归10g，桃仁10g，红花10g 氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、二甲亚砜、水 多酚氧化酶粗酶、邻苯二酚、 0.2mol/L磷酸钾缓冲液(Ph6.8） 四、实验步骤 粗提物制备：将复方中药材用70%乙醇水溶液浸泡一周， 过滤，滤液浓缩后得到粗提物浸膏。 分级萃取：取5g粗提物与35g层析硅胶拌样后装柱，分别用氯仿⑴、乙酸乙酯⑵、乙酸乙酯-20%乙醇⑶、乙酸乙酯-40%乙醇⑷、乙酸乙酯-60%乙醇⑸、乙酸乙酯-80%乙醇⑹、乙醇⑺、乙醇-20%水⑻、乙醇-40%水⑼、乙醇-60%水⑽、乙醇-80%水⑾洗脱（20ml×3），浓缩后得到11个分级产物。 样品浓度(g/ml)：各分级产物加1ml DMSO（1~4ml）。 活性筛选： （1）多酚氧化酶酶催化活力的预测定：将粗酶用pH6.8 0.2mol/L磷酸 四、实验步骤 钾缓冲液溶解配成10ml左右。在含有0.93ml pH6.8的0.2mol/L磷酸钾缓冲液的离心管中加入10?l 0.025mol/L邻苯二酚溶液，50?l DMSO，在30℃恒温水浴中预热后或室温直接加入10?l酶液，在紫外可见分光光度计405nm处测时间扫描值。OD值一般在0.1-0.5/min之内，如果过大，请减少酶液的用量或者将原酶液稀释后再测定。如果在0.1/min范围，可以稀释5倍以备下步实验。 （2）分级样品酶活性测试：取96孔酶标板一块，按表在孔中加入稀释后的酶液10?l，样品10?l，每孔总体积为0.2ml，DMSO浓度保持在5%，然后加邻苯二酚溶液10?l，酶标仪上405nm上立即测定，2分钟后再测一次，根据两次测定的结果计算酶催化反应速率，再计算抑制率。 将具有较好酶抑制活性的分级产物制作美白面膜并比较使用前后的变化。 3 缓冲液200?l ⑴ ⑵ ⑶ ⑷ ⑸ ⑹ ⑺ ⑻ ⑼ ⑽ ⑾ 缓冲液 缓冲液 缓冲液 无抑制体系 无抑制体系 无抑制体系 无抑制体系 无抑制体系：10?lDMSO，170?l缓冲液；稀释5-10倍的粗酶液（根据前面测试结果稀释）10?l，最后统一加10?l加邻苯二酚溶液。 其它各排按倍稀释法稀释： 1行2列：20?l分级的混合物溶液（1）；160?l缓冲液 混合后取出90?l 加入到2中，1中补加90?l 缓冲液，稀释5-10倍的粗酶液10?l，最后统一加10?l邻苯二酚溶液；2行2列：80?l缓冲液，10?lDMSO，90?l 来自1的溶液，混合后取出90?l 加入到3中，2中补加90?l 缓冲液，稀释5-10倍的粗酶液10?l，最后统一加10?l加邻苯二酚溶液。同法至8行2列。 1行3列（分级混合物溶液（2））---8行3列，同上。 依次类同，添加完毕后立即进行测试。 五、实验要求 准备好仪器及试剂，规范操作，切勿盲目进行实验。 实验台面保持整齐干净，随时整理，留有最大的工作空间。 公用仪器、药品使用后立即放回原处。 装有易燃性药品的容器不得放在近火旁。 实验完毕后，回收废液，所用仪器洗净放好。检查水、电、仪器开关是否关好。 及时处理实验数据，按照要求撰写实验报告。 结果与讨论――报告的重要部分！ （1）数据处理 （2）结果分析 实验 愉快;) * *