RNA文库构建——张晓敏pdfx.pdf

新人培训 张晓敏 RNA建库组 2015年5月27 日 培训内容 RNA文库类型 建库原理 建库流程 注意事项 RNA分子的类别 RNA文库类型 真核普通转录组文库 DGE文库 真核链特异性文库 原核链特异性文库 LncRNA文库 SmallRNA文库 真核普通转录组和DGE文库建库流程 Total RNA 样品检测 mRNA 富集 双链 cDNA 合成 末端修复加A加接头 片段选择和PCR富集 文库质量检测 Illumina sequencing 1.取样 核对样品的名称、诺禾编号、样品是否异常等信息 6 2. mRNA 富集（真核普通/链特异性、DGE文库） oligodT磁珠富集mRNA 的 原理是基于真核mRNA有一 段polyA尾，oligodT磁珠表 面则有许多T 的寡核苷酸， mRNA就会被吸附在磁珠上， 其余rRNA会被去除。 3. RNA fragmentation 94℃孵育15min。立刻放置冰上。（150-200bp） 4. First Strand /Second Strand cDNA Systhesis 8 5. End Repair/dA-tail、Adaptor Ligation 目前根据二链的浓度大小确定接头的加入比例。 1 ng/µl，接头稀释2倍（0.5 μl） 1 ng/µl，接头稀释 倍（0. μl），补水至18.5 μl 9 6.Size Selection of Adaptor-ligated DNA 0.57X XP磁珠去除大片段 0.25X XP磁珠保留目标片段 等体积XP磁珠纯化去掉小片段 7.USER Excision and PCR library Enrichment 8.Purify the PCR Products （XP磁珠纯化） 第一遍 0.85X XP磁珠纯化 第二遍 1X XP磁珠纯化 上 -RNA 待检文库信息单 建库完成后,按照如下格式整理RNA待检文库信息单,填入相关信息, 特别要注意:诺禾编号、文库名、index 信息一定要填写准确。 文库质量检测 1.Qubit初步定量 稀释文库至1.ng/ul Small RNA文库 2.Agilent 2100检测