FANCF基因沉默对人卵巢癌OVCAR3细胞生物学行为影响及分子机制.pdfVIP

四、 五、 —土． ／、、 ·中文论著摘要· FANOF基因沉默对人卵巢癌OVCAR3细胞 生物学行为的影响及分子机制 刖菁 范可尼贫血(FanconiAnemia，FA)是一种罕见的常染色体退行性 疾病，其表现为染色体不稳定性，进行性骨髓抑制和肿瘤易感性。范可 anemia／breastcancer 尼贫血／乳腺癌易感基因(Fanconi susceptibility 伤修复的功能，靶向FA复合体的任何一个蛋白组分，都可以增强DNA 交联剂的化疗效果，该通路中任何基因表达缺陷都会损害通路的正常功 能发挥，范可尼贫血互补基团F(Fanconianemia，complementationgroup 白低表达或缺失会干扰FA／BRCA通路的正常功能，影响DNA损伤修复 的进行。另外，FA／BRCA通路功能缺失会导致2条压力应激信号通路的 异常激活，MAPK信号通路和NF．KB信号通路。卵巢癌细胞，由于基 因组的不稳定性，化疗初始对化疗药非常敏感，但均不可逆转的逐渐变 得耐药。以往关于FANCF基因的研究主要集中于启动子甲基化方面，因 物学特性的影响，化疗药阿霉素敏感性的变化，阻断FA／BRCA通路的 效果，及对MAPK通路和凋亡通路蛋白的影响。 实验方法 1．脂质体法转染卵巢癌细胞OVCAR3； 2．EGFP．N3质粒间接估计转染效率； 3．Western blotting验证FANCF基因沉默效果； 4．流式细胞仪检测FANCF基因沉默后入卵巢癌细胞OVCAR3的阿 霉素细胞内含量； 性的影响； 6．JC．1检测FANCF基因沉默对线粒体膜电位的变化； 7．彗星实验(单细胞凝胶电泳)测定FANCF基因沉默对细胞DNA 损伤断裂情况； 8．Western 亡通路蛋白的影响。 实验结果 1．EGFP．N3质粒间接估计转染效率 使用增强型绿色荧光蛋白质粒EGFP．N3质粒间接估计转染效率，采 用流式细胞仪测定的转染效率为：①lpg，2弘l：23．06％；②2pg，4I．tl- 脂质体4肛l。 2．Western blotting验证FANCF蛋白表达的变化 转染后阴性对照组在24h、48h、72hFANCF蛋白的表达变化不大， 表达siRNA的质粒沉默效果很好，质粒构建成功。 3．流式细胞仪检测FANCF基因沉默后阿霉素细胞内含量 转染24h后三个组别的细胞加入O．1}tg／ml的阿霉素，含阿霉素的细 胞百分比，含阿霉素细胞的平均荧光强度，FANCF．shRNA组与阴性对 照组、未转染组比较都明显的增大。说明FANCF基因沉默能够促使更多 的阿霉素进入细胞内。 性的影响 长状态发生了很大变化，FANCF．shRNA组的细胞与阴性对照组比较， 2 浓度阿霉素作用下，FANCF．shRNA转染组的化疗敏感性提高。 未转染组，阴性对照组，FANCF．shRNA组的细胞的IC50值分别为： 化疗药阿霉素的敏感性提高了。 粒体膜电位的影响 卵巢癌细胞OVCAR3转染24h时绿色荧光反应的凋亡早期细胞的比 有统计学意义；绿色荧光与红色荧光的比率，由0．061±0．009增加到 0．11 0±0．004；FANCF基因沉默促使更多的细胞进入到早期凋亡阶段。 24h，未转染组，阴性对照组和FANCF．shRNA组都出现了绿色荧光的增 12．62±1．47和阴性对照组17．58±1．85；凋亡早期细胞与未发生凋亡细胞 在化疗药阿霉素的作用下，虽然各组细胞都出现了线粒体膜电位的下降， 但是FANCF基因沉默，会使化疗药引发细胞凋亡的作用进一步加强。 6．彗星实验(单细胞凝胶电泳)测定FANCF基因沉默对细胞DNA 损伤断裂 未出现拖尾现象。卵巢癌细胞OVCAR3转染24h后给予化疗药阿霉素处 理24h，细胞都出现了DNA损伤，彗星实验中出现拖尾现象，尤其是 ±26．87和阴性对照组85．91±21．59；尾矩的