CXCL16基因与红色荧光蛋白pDsRed2-N1融合基因表达载体的构建.pdfVIP

中国肿瘤生物治疗杂志 · 578· Chinese Journal of Cancer Biotherapy Vo1．14 No．6 Dec．2007 [文章编号] 1007．385X(2007)06-0578-04 ·短篇论著· CXCL16基因与红色荧光蛋白pDsRed2·N1融合基因表达载体的构建 Construction of CXCL16／RFP fusion gene expression vector 刘厚佳 ，郭献灵 ，杨 阳 ，芮耀诚 ，卫立辛 ，吴孟超 ，张 黎 (1．第二军医大学 附属长海医院，200433；2．第 二军医大学附属东方肝胆外科医院，200438；3．第二军医大学药学院药理学教研室，200433) [摘 要] 目的：构建人趋化因子配体16(CXC ligand 16，CXCL16)与增强型红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)的 融合基因表达载体pDsRed2·N1／CXCL16，使CXCL16·RFP融合蛋白在人293T细胞中稳定表达。方法：针对CXCL16基因设 计引物，扩增人CXCL16 cDNA，退火后插入含有RFP的表达载体pDsRed2·N1。测序正确的CXCL16和RFP的融合基因表达 载体pDsRed2．N1／CXCL16，经脂质体转染人293T细胞株，G418筛选获得稳定转染的细胞株。荧光显微镜观察细胞转染情况， Western blotting比较转染前后293T细胞中CXCL16蛋白的表达变化。结果：经转化细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列 分析证实，CXCL16基因已正确插入pDsRed2．NI中 基因的上游，获得融合基因表达载体pDsRed2．N1／CXCL16。空载体 pDsRed2·N1和融合基因表达载体pDsRed2·N1／CXCLI6经脂质体转染人293T细胞后，在荧光显微镜下可观察到表达RFP的 细胞发出红色荧光，转染效率分别可达95％和85％ 。pDsRed2·N1／CXCL16转染293T细胞后，CXCL16蛋白的表达水平显著 上调。结论：成功构建的pDsRed2．N1／CXCL16融合基因表达载体可在293T细胞中稳定表达CXCL16蛋白，为进一步研究 CXCL16在细胞增殖调控中的作用奠定了基础。 [关键词] 趋化因子配体16；清道夫受体；重组融合基因；表达载体 [中图分类号] Q782 [文献标志码] A 人趋化因子配体16(CXC ligand 16，CXCL16) 接酶、DNA Marker 2 000为Takara公司产品，质粒 是新近发现的一种G蛋白偶联受体CXC趋化受体 抽提纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒为QIAGEN公 6(CXC receptor 6，CXCR6)的趋化配体¨ ，同时又 司产品，DMEM、OPTI—MEM培养液、胎牛血清为 是结合磷脂酰丝氨酸和氧化脂蛋白的细胞表面受 Gibco公司产品，LipofectamineⅢ2000为Invitrogen 体，是氧化低密度脂蛋白(Ox—LDL)的特异性清道夫 公司产品，细胞总蛋白提取试剂盒为Pierce公司产 受体 J，由于其同时兼备清道夫受体及趋化因子的 品，ECL+plusTM Western blotting system试剂盒为 作用，提示其可能在炎症及免疫系统中具有重要作 Amersham公司产品。小鼠抗人Actin单克隆抗体， 用。 辣根过氧化物酶标记驴抗小鼠二抗为Santa Cruz公 为进一步探讨CXCL16在细胞中的作用，本研 司产品，倒置荧光显微镜为 Olympus公司产品。 PCR引物由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。 究在克隆人CXCL16基因的基础上，构建增强型红 其余试剂均为国产分析纯试剂。 色荧光蛋白(red fluoresce