地高辛标记cRNA探针实验方法.PDFVIP

中国试剂网 3.18.9 地高辛标记 cRNA 探针实验方法 1 ．组织前处理在组织制片中以冷冻切片（厚 10～30μm ）最佳。切片贴在预 先清洁，高温处理并涂以粘附剂载玻片上，先在 37℃预干燥4h ，然后置于 37℃ 烤箱中过夜。经过上述处理的切片如在-20℃可保存 2～3 周，在-70℃可保存数 月之久，有报告可保存数年之久的。但仍以新鲜制片为好。如为石蜡包埋切片， 应脱蜡经梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在细胞内 mRNA 含量 高时应用二甲苯脱蜡后仍能显示。经水洗后入 37℃烤箱4h 或过夜，然后进行杂 交前处理。 在烘烤及低温保存时，为防尘埃及空气中 RNA 酶的污染，宜用锡箔纸 （foilpaper ）包被，内加少许干燥剂（变色硅胶）。 下列步骤所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。 （1）PBS 洗 2×3min 。 （2 ）选择少数几张切片作为“RNA 酶对照片” 。 其它切片暂放于 PBs 内。 RNA 酶对照片处理方法：加 RNA 酶（100μg/ml ）在预热37℃的溶液内。放 在潮湿的盛有少许 2×SSC 塑料盒或蒸发皿内。在每张切片上覆以过量的 RNA 酶 溶液，在 37℃孵育 30min 后用 2×SSC 冲洗，2×3min ，然后与其它保存在 PBS 的切片一起进行下列处理。 （3 ）蛋白酶K 消化：将组织切片放在 0.1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0， 内含蛋白酶K1μg/ml，孵育 15～20min 。消化时间应根据组织的种类，厚度反复 试验调整。时间过短探针不易进入，过长影响细胞或组织的形态结构。 （4 ）0.1mol/L 甘氨酸/PBs 5min 终止蛋白激酶 K 反应。0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制）10min。 （5 ）在4%多聚甲醛/PBS3min 。 （6 ）以PBs 漂洗 2×3min 。 （7 ）浸入新鲜配制的0.25%乙酸酐（0.1mol/L 三乙醇胺配制）10min，以封 闭非特异性结合部位。 （8 ）2×SSC 漂洗 15min。 2 ．杂交以含cRNA 探针（0.5ng/ml ）的杂交液，按每张切片 10～2μl 的量覆 中国试剂网 3.18.9 盖切片。地高辛配基标记的 cRNA 核酸探针保存浓度为 2.5ng/ml ，用前稀释备用。 覆以硅化盖玻片或塑料蜡膜，置于盛有少量 2×SSC 温盒内在 42 ℃，16～18h 或 过夜。 3 ．显示 （1）用缓冲液 1 冲洗杂交后的载片 2×3min 。 （2 ）在缓冲液 1 中 10min，室温以封闭非特异性结合部位。 （3 ）拭干切片周围的载片，注意保持切片湿润。加数滴抗地高辛抗血清（工 作浓度 1：500，以缓冲液 1 稀释），孵育2h ，室温。 （4 ）缓冲液 1 漂洗 3×3min 。 （5 ）浸入缓冲液210min 室温。 （6 ）浸入底物中孵育 10～30min （或更长时间，视需要而定），底物内含显 色 BCIP/NBT ，室温。最好用锡箔纸包裹反应盒，使显色在黑暗中进行。定期取 出切片在显微镜下检测反应强度。根据反应强度决定延长或终止反应。反应颜色 为紫蓝色。 （7 ）将切片浸入缓冲液3 以终止反应。 （8 ）复染，可用 1%伊红、1%苏木精、1%亮绿或 5%的焦宁（又称派咯宁 丫）（pyronin 丫）10～30s 。 （9 ）流水洗5～10min，直至水无色为止。 （10）在切片未干前，以PBS/甘油封固切片，如要永久保存，可以用 DPX 在盖片四周封固。为去除水份，在封固前可进行梯度酒精脱水，透明，DPX 封 固，但每步时间仅需几秒钟，时间过长易致褪色。