鼠伤寒沙门氏菌回复突变实验.docVIP

实验二 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（5009.9-2003 食品中淀粉的测定 1、了解化学毒物致突变性分析的原理及分析要求。 2、掌握回复突变的测试方法。 二、实验原理 鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。 某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变， 故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。 三、培养基和试剂 1、 0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液 成分： L-组氨酸(MW 155) 78mg D-生物素(MW 244) 122mg 加蒸馏水至 1000ml 配制：将上述成分加热，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高压灭菌20min。贮于4℃冰箱。 2、顶层琼脂培养基 成分： 琼脂粉 1.2g 氯化钠 1.0g 加蒸馏水至 200ml 配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。实验时，加入0.5mmol/L组氨酸—0.5mmol/L生物素溶液20mL。碘溶液：称取3.6克碘化钾溶于20毫升水中，加入1.3克碘，溶解后加水稀释至100毫升。 3、Vogel-Bonner (V-B) 培养基E 成分：枸椽酸(C6H8O7·H2O) 100g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 500g 磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O) 175g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 10g 加蒸馏水至 1000ml 配制：先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中，加蒸馏水至1000mL。于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。 4、20%葡萄糖溶液 成分：葡萄糖 200g 加蒸馏水至 1000ml 配制：加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖，再加蒸馏水至1000mL。于0.068MPa下高压灭菌20min。储于4℃冰箱。 5、底层琼脂培养基 成分：琼脂粉 7.5g 蒸馏水 480ml V-B培养基E 10ml 20%葡萄糖溶液 10ml 配制：首先将前两种成分于0.103MPa下高压灭菌30min后，再加入后两种成分，充分混匀倒底层平板。按每皿25mL制备平板，冷凝固化后倒置于37℃培养箱中24h，备用。 6、营养肉汤培养基 成分：牛肉膏 2.5g 胰 胨 5.0g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.0g 加蒸馏水至 500mL 配制：将上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。 7、盐溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2) 成分：氯化钾(KCl) 61.5g 氯化镁(MgCl2·6H2O) 40.7g 加蒸馏水至 500ml 配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。 8、0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4) 成分：磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)