云南牟定狂犬病诊断及病毒部分N基因测序.pdfVIP

· 56· Animal HusbandryVeterinary Medicine 2007 Vo1．39 No．1 1 云南牟定狂犬病诊断及病毒部分N基因测序 赵焕云 ，张文东 ，金卫华 ，杨 斌 ，李朝仓 ，宋建领 ，何晓辉 ，周建国 ， 胡媛媛 ，王永贤 ，张应国 ，范泉水 ，李作生 ，高云英 ，张富强 (1．西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100；2．云南省动物疾病预防控制中心，云南昆明 650051； 3．昆明市畜牧兽医站，云南昆明 650223；4．云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224； 5．成都军区疾病预防控制中心，云南昆明 650032；6．楚雄州畜牧兽医站，云南楚雄 675000) 摘要：自英国引进3株荧光素标记的针对狂犬病毒核蛋白的单克隆抗体，建立狂犬病直接免疫荧光诊断技术。根据已知狂犬病毒核蛋白 (N或 NP)基因序列，设计合成4对引物，建立狂犬病RT—PCR及套式PCR诊断技术。自牟定采集发病犬脑组织样品15份，免疫荧光及PCR诊断结果 均为阳性。刈PCR产物进行纯化后，克隆至pMD18一T载体测序 (基因库登录号：EU095330)，并与已知代表毒株对应序列进行比对及系统发育分 析．结果表明：云南牟定狂犬病毒属于基因1型和血清1型毒株，与2006年广西发病犬分离毒株遗传关系密切，病毒部分N基因核苷酸及推导的 氨基酸序列同源性分别为97．4％和99．O％。 关键词：云南；狂犬病；诊断；核蛋白基因；测序 中图分类号：$855．3 文献标识码：B 文章编号：0529—5130(2007)l1—0056—04 狂犬病 (Rabies)是由狂犬病毒 (Rabies virus，RV)引 序列进行克隆、测序，并与国内外已知代表毒株对应序列进行 起，严重侵害中枢神经系统的一种重要人畜共患传染病。人及 比对及系统发育分析，研究云南狂犬病病毒N基因结构特征 所有温血动物均能感染…，据WHO统计每年大约有50000余 及与已知毒株的遗传相关性，为本地区狂犬病的分子流行病学 人死于该病。狂犬病毒为弹状病毒科 (Rhaboviridae)狂犬病 调查及防控提供指导。 毒属 (Lyssaavirus)成员，至少存在5～6个血清型 。基于 1 材料和方法 病毒核蛋白 (N)基因、糖蛋白 (G)基因结构和变异特征， 分子遗传学研究证实并进一步深化血清型划分，可将狂犬病毒 1．1 毒株及抗体 分为2个进化组群、7个基因型，第一组群包括基因型1、4、 狂犬病弱毒冻干疫苗，购自辽宁益康生物制品有限公司。 5、6、7，第二组群包括基因型2、3，7个基因型中前4个基 3株荧光素标记的NP单克隆抗体购自英国Chemicon有限公 因型及基因型5、6分别与已知的5个血清型相对应 。具 司，单克隆抗体浓度均为0．5 mg／mL。 有属特异性，含有狂犬病毒及狂犬病相关病毒特异性共有抗原 1．2 野外样品 表位，是狂犬病血清学及分子生物学诊断技术、病原学及分子 采自云南省楚雄彝族自治州牟定县病犬脑组织样品 (小 流行病学研究的主要对象之一。国内外对狂犬病进行了大量研 脑、脑干、海马角)15份。 究，建立一批较为成熟的特异性诊断方法 ，开展了病毒基 1．3 质粒与菌种 因结构特征分析及毒株遗传变异规律 、地理起源及分子 TaKaRa pMD18一T载体购自宝生物工程 (大连)有限公 流行病学等研究 。 。云南省是狂犬病高发区，2006年7月 司。DH5ct大肠埃希氏菌本实验室保存。 楚雄州牟定县2／3区域出现 “疯狗”咬人事件，3人出现典型 1．4 引物设计与合成 狂犬病症状并死亡，全县扑杀犬5万余只，损失惨重。本研究 根据已知狂犬病毒N基因测序数据，参照近年国外发表 通过建立狂犬病直接免疫荧光、RT—PCR、套式PCR诊断技 的引物序列 ，设计合成4对引物(表1)。质粒测序引物参 术，进行狂犬病病原学诊断