缺锌对大鼠骺板软骨细胞增殖和凋亡的影响及其机制.pdfVIP

·中文论著摘要· 缺锌对大鼠骺板软骨细胞增殖和 凋亡的影响及其机制 目 的 锌是人体中200余种酶的组成成分，并是许多酶的催化剂，故能促进DNA、 蛋白质、胶原的合成，促进生长发育。锌缺乏会使机体的代谢平衡受到破坏，从而 影响其他营养素(包括微量元素)在机体中的作用，可使骨密度发生改变，引起骨 生长迟缓，对少年儿章生长发育有严重的影响。近年来的研究表明，哺乳动物细 胞内有一类类似ATP酶的蛋白质一锌转运蛋白家族(Zinc transporters，ZnTs)，可 转运锌离子，并调节质膜内外锌离子浓度。ZnT-1(锌转移蛋白1)是ZnTs家族中 重要的组成部分，它定位于细胞膜表面上，将锌离子从细胞外聚集到细胞体内， 用于细胞内各种含锌蛋白的合成和加工，其中包括很多参与调节细胞基因表达的 DNA结合蛋白。本文从缺锌状态下骺板软骨细胞的增殖和凋亡入手，并探讨缺 锌与ZnT-1表达的关系。 材料与方法 1．大鼠生长板软骨细胞原代培养：雄性vista大鼠，断颈法处死，进行软骨细胞 培养并进行鉴定。 2．细胞缺锌模型的制备：向无血清培养液内加入不同浓度锌螯合剂TPEN(5uM、 10¨M、20p．M)作用24h，造成软骨细胞锌缺乏。 3．MTT法检测细胞增殖倍数：将不同浓度的培养液加入96孔培养板中，加入 ◆ 培养的软骨细胞，同时设空白对照。培养24h后，每孔加入溴化二甲噻哗二 k 苯四氮哗(MTT)，继续培养4-6h后弃上清，加入盐酸异丙醇充分溶解，测量 570nm和630nm的OD值，通过曲线测得产物浓度，分析细胞增殖情况。 4．流式细胞学检测凋亡：不含EDTA的胰酶常规消化细胞，PBS沈两遍，加入 Annexin V反应30 200弘lBindingbuffer，重悬后加入10¨l min，再加入5“lPI 和300 buffer，混匀反应5min后上机检测。 lal Binding 5．定位、定量检测ZnTl在对照组和实验组大鼠骺板软骨细胞的分前j和变化。 Realtime．PCR和Westem Blotting方法。 6．统计学分析实验重复3次，数据以均数±标准差表示，两组对照采用t检验比 较，三组以上采用方差分析比较实验各组均数与对照组均数之I、日J的差异，以P 0．05为差异有统计学意义。 实验结果 1．细胞培养：原代培养的生长板软骨细胞中95％以上的细胞I、1I型胶原阳性 染色，细胞核周围和细胞膜周边都有II型胶原的阳性染色，阳性染色的纤维 包裹着细胞核，保持圆形的细胞呈强阳性染色。而X型胶原染色没有阳性反 应。 2．MTT检测结果：通过MTT检测随TPEN的浓度的增高，软骨细胞后24h细 胞相对存活率逐渐降低。 V M