10第10章维生素的测定2014.ppt

5．说明与讨论 食品中维生素D的含量一般很低，而维生素A、维生素E、胆固醇，甾醇等成分的含量往往都大大超过维生素D、严重干扰维生素D的测定，因此测定前必须经过层析除去这些干扰成分。 可参考柱层析图 此法不能区分D2和D3，测定值是两者的总量。 四、维生素E的测定 测定方法 比色法 荧光法 GC法 HPLC法（VA、VE） （一）HPLC法（VE） 1．原理 试样中的维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将维生素E分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。 维生素A和维生素E色谱图 (二)　比色法 1．原理 维生素E能将高铁离子还原为低铁离子，低铁离子与α，α’—联氮苯发生颜色反应，可以进行比色测定。500nm 3、测定步骤 (1)样品处理 ①皂化 ②纯化 (2)样品测定 (3)标准曲线的绘制 5．说明与讨论 ①维生素E在碱性条件下与空气接触易被氧化，因此在皂化时，用氮气流保护，也可加入焦性没食子酸作为抗氧化剂，防止维生素E的氧化。 ②此方法的反应没有特异性，当有其他还原性物质存在时，同样能与Fe+3反应生成Fe2+，使测定结果偏高，故处理前应将它们除去。 ⑤由于光能促进维生素E氧化，因此尽可能避光操作 本章重点与难点内容 1 维生素的分类 2 试说明常见几种维生素的测定方法及其原理。 3测定脂溶性维生素样品需如何处理？ 4测定水溶性维生素时，从样品中提取浓缩可采用哪些方法？ 结果计算 所用氯仿中不应含有水分，因三氯化锑遇水会出现沉淀，干扰比色测定。 故在每m1氯仿中应加入乙酸酐1滴，以保证脱水。 说明与注意点 维生素A见光易分解，整个实验应在暗处进行，防止阳光照射，或采用棕色玻璃避光。 测定结果也可以每100g食品中所含维生素A的国际单位表示，每国际单位维生素A相当于0.3μg维生素A。 1μg胡萝卜素=0.167μg视黄醇当量。以往VA的量常用国际单位（IU）表示。 1　IUVA=0.33μgVA=0.33μg视黄醇当量。 三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上；三氯化锑遇水生成白色沉淀，因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。 比色法除用三氯化锑作显色剂外，还可用三氟乙酸、三氯乙酸作显色剂。其中三氟乙酸没有遇水发生沉淀而使溶液混浊的缺点。 (二)紫外分光光度法 1.原理 维生素A的异丙醇溶液在325nm波长下有最大吸收峰，其吸光度与维生素A的含量成正比。 2．适用范围及特点 本法的灵敏度较比色法高，可测定维生素A含量低于5μg／g的样品。主要缺点是在维生素A最大吸收波长325nm附近许多其他化合物也有吸收，干扰测定， 故本法适用于透明鱼油，维生素A的浓缩物等纯度较高的样品。对于一般样品，测定前必须先将脂肪抽提出来进行皂化，萃取其不皂化部分，再经柱层析除去干扰物。 （三）高效液相色谱法 1、原理（GB/T5009.82-2003第一法） 皂化、提取样品中的维生素A和维生素E后，用高效液相色谱法C18反相柱将两者分离，用紫外检测器检测，内标法定量。 测定步骤 （1）样品处理（皂化、提取、洗涤、浓缩） （2）标准曲线的制备 二、β—胡萝卜素的测定 450nm波长处有最大吸收 HPLC法（GB/T5009.83） 纸层析、 柱层析 薄层层析法 β-胡萝卜素含有两个维生素A1的结构，称为维生素A原。 一、高效液相色谱法 1原理 试样中的β-胡萝卜素，用石油醚+丙酮(80+20)混合液提取，经三氧化二铝柱纯化，然后以高效液相色谱法测定，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。 二、纸层析法 1．原理： 以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素；以石油醚为展开剂进行纸层析。胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其它色素分开。剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450nm波长下进行比色，测定。 4、测定步骤 （1）样品提取与洗涤(石油醚） （2）浓缩与定容 （3）纸层析 （4）比色测定 （5）标准曲线的绘制 ①点样：带状点样 ②展开 ③洗脱：剪下位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带，石油醚 5、结果计算 6．说明与讨论 ①此法也为国家标准方法，方法简便，色带清晰，最小检出限为0.11μg 。 ②样品和标准液的提取一定要注意避免丢失。 ③浓缩提取液时，一定要防止蒸干，避免胡萝卜素在空气中氧化或因高温、紫外线直射等破坏。定容、点样、层析后剪样点等操作环节一定要迅速。 三、维生素D的测定 7-脱氢胆固醇经光照可转变为VD3 维生素D的测定方法有： 比色法、 紫外分光光度法、 气相色谱法、 液相色谱法 薄层层析法 （