酪氨酸激酶受体B论文活性羧肽酶E海马神经元膜表面水平.docVIP

酪氨酸激酶受体B论文：活性羧肽酶E海马神经元膜表面水平 【提示】本文仅提供摘要、关键词、篇名、目录等题录内容。为中国学术资源库知识代理，不涉版权。作者如有疑义，请联系版权单位或学校。 【摘要】一.研究背景神经元突触可塑性不仅在发育期对神经环路的建立起重要作用,而且在成年期参与控制脑的认知功能和复杂行为。脑源性神经营养因子(BDNF)不仅能促进神经元的存活、分化以及树突、轴突的生长,而且在调节突触的可塑性方面也起到关键作用。大量研究已表明BDNF对神经元突触的调控,受神经元活性的调节,BDNF优先作用于有活性的神经元或突触。BDNF的功能受体主要有两类：p75神经营养素受体和TrkB酪氨酸激酶受体,其中,TrkB是其的高亲和力受体,而且是介导BDNF功能发挥的关键分子。因此,神经元表面TrkB受体的水平对于BDNF功能的发挥具有重要作用。大量研究显示活性刺激能促进神经元膜表面TrkB受体水平的显著升高,例如高K+刺激,高频电刺激及Glycine(化学性LTP诱导剂)作用等。这在一定程度上解释了BDNF对神经元的作用受神经元活性的调节,因为高活性的神经元膜表面的TrkB受体含量较高,更容易接受来自BDNF的信号。但神经元活性促进膜表面TrkB受体含量增加的分子细胞学机制尚不十分清楚。TrkB受体的胞内域是调控其运输的关键区域,于是用TrkB受体胞内域为诱饵进行酵母双杂交,钓取有可能与TrkB结合并调控其活性依赖性胞内转运的分子—CPE。CPE分子存在两种形式：游离型和膜结合型。游离型CPE主要发挥羧肽酶的功能；而膜结合型CPE是一种既可以参与调节性分选,介导POMC,胰岛素等进入调节性运输途径,也可以作为中间分子介导调节性囊泡的运输等的多功能分子。那么,CPE与TrkB的这种结合,是否对TrkB受体的活性依赖的调节性胞内运输过程有功能意义呢?二.研究目的本研究旨在证实CPE能调控TrkB受体神经元活性依赖的胞内转运,从而有助于我们进一步探究神经元活性促进TrkB受体膜表面水平升高的机制,并由此为临床BDNF所介导的精神疾病及学习记忆功能等提供参考。三.研究方法1.免疫共沉淀实验。免疫共沉淀技术,是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。在293细胞中过表达相应的各种CPE或TrkB的突变体。裂解细胞收集上清,根据特异识别不同分子的相应抗体偶联的琼脂糖珠子进行免疫沉淀,那么与之结合的分子也会共沉淀下来,之后用Western blot技术进行检测。通过此方法可以确定CPE与TrkB的结合及具体结合区域。2.免疫荧光实验。免疫荧光即根据抗原抗体反应的特异性用荧光抗体示踪或检查相应抗原。我们利用该技术对外源过表达的CPE与TrkB在海马神经元的定位情况进行荧光标记,并通过激光共聚焦显微镜进行观察记录。利用该技术,检测干扰CPE的表达后,Glycine活性刺激对TrkB在树突棘及对应树突干的相对分布是否有影响。免疫荧光实验,检测干扰CPE表达对BDNF-TrkB所介导的树突棘生长及形态可塑性的影响。3.全内反射荧光(TIRF)显微镜技术。TIRF显微镜技术广泛应用于细胞表面附近分子的动态观察。在海马神经元中共转染CPE-RFP和TrkB-GFP两种质粒。在活细胞状态下,分别在Glycine刺激前后,观察拍照,记录CPE-RFP和TrkB-GFP的在膜表面附近的共定位的点的运动情况。4. Western Blot实验。Western Blot是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。本研究中用于检测一系列免疫共沉淀结果,膜表面生物素结果及CPE对活性条件下的BDNF-TrkB介导的下游信号通路功能的影响的结果。5.膜表面生物素标记实验。用生物素标记细胞膜表面的蛋白,收集细胞裂解液,然后用与生物素有高亲和力的亲和素分离膜表面蛋白,最后用Western blot技术及相应的抗体进行检测。在海马神经元中干扰内源CPE的表达,研究CPE对神经元中内源TrkB活性依赖的上膜的影响。6.免疫荧光染色定量分析法。将TrkB及其突变体的N端融合Flag标签,C端融合GFP绿色荧光蛋白。参照赵玲老师已发表的文章中已建立的膜表面荧光定量分析法,在神经元中转染这些质粒,然后进行免疫细胞化学实验,在非透化情况下,用594荧光素标记Flag,代表的是膜表面的TrkB或其突变体结构；GFP绿色荧光显示的是总的TrkB或其突变体结构,再将红绿荧光比值通过已知的比率换算,即可得出膜表面TrkB或其突变体的分布比例情况。如果同时共转CPEsiRNA或CPE DN质粒等,即可检测它们对TrkB受体的活性上膜过程的影响。四.研究结果前期山东大学神经生物研究所