贫铀对体外培养成骨细胞毒性作用.docVIP

贫铀对体外培养成骨细胞毒性作用摘要： ［目的］ 研究贫铀（depleted uranium，DU）对体外培养大鼠成骨细胞（osteoblast，OB）的毒性损伤作用，为DU对骨损伤防治提供依据。 ［方法］ 分离并培养原代成骨细胞，分别给予不同浓度（0.001 95 ～0.031 2 mg/ml）的DU溶液，噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖率以观察DU对OB增殖的影响；对硝基苯磷酸二钠盐（PNPP）法测定细胞裂解液中碱性磷酸酶（ALP）活性以观察DU对OB分化能力的影响；矿化结节形成能力和面积测定以观察DU对OB矿化能力的影响。 ［结果］ DU处理组OB增殖率、ALP活性均呈不同程度降低，且随着DU染毒剂量的增加和时间的延长，DU对OB增殖率和ALP活性的抑制作用更加明显，其中0.007 8、0.015 6、0.031 2 mg/ml等染毒剂量组与正常对照组相比，差异有统计学意义（P 1.2.2 成骨细胞的鉴定 用倒置相差显微镜观察成骨细胞形态，NBT/BCIP染色试剂盒进行细胞ALP染色，显微镜下观察拍照 1.2.3 DU对成骨细胞增殖的影响（MTT法） 将第2代对数生长期细胞以2.5×103/孔接种于96孔板，每组12复孔。待细胞汇合后染毒。DU染毒剂量分别为0.001 95、0.003 9、0.007 8、0.015 6、0.031 2 mg/ml，对照组加入相同体积的生理盐水（空白对照）或低浓度HNO3（HNO3对照即试剂对照）。继续在5% CO2、37℃的恒温培养箱中培养24、48、72 h后终止培养。测定前4 h，用PBS冲洗后更换无血清MEM培养液100 μl，同时加入10 μl 0.5% MTT，培养箱中孵育4 h，加入150 μl 10% SDS，37℃ 水浴振荡2 h，冷却至室温后在酶标仪上570 nm处测定每孔的吸光度值（D570）。结果与空白对照和HNO3对照比较 1.2.4 DU对成骨细胞ALP活性的影响（PNPP偶氮法） 细胞接种同增殖率测定。DU染毒剂量分别为0.001 95、0.003 9、0.007 8、0.015 6、0.031 2 mg/ml，对照组加入相同体积的生理盐水（空白对照）或低浓度HNO3（HNO3对照即试剂对照）。继续在5% CO2、37℃的恒温培养箱中培养24、48、72 h后终止培养。弃去培养液，PBS冲洗3次，每孔加入0.05% Triton-x 100 μl超声裂解。取细胞裂解液50 μl于4 ℃预冷的96孔板，再加入150 μl的ALP底物反应液（PNPP-DEA溶液），然后于37℃恒温振荡箱中放置30 min，以NaOH 0.1 mol/L终止反应，酶标仪在405 nm处测定每孔的吸光度D值（D405）。另取4 μl细胞裂解液，按照BCA法蛋白定量检测试剂盒说明进行蛋白定量检测。ALP活性最终以U/mg蛋白表示。结果与空白对照和HNO3对照比较 1.2.5 DU对成骨细胞矿化能力的影响 将第2代对数生长期细胞以5×104/孔密度接种于24孔培养板，每组4复孔。培养24 h后进行DU染毒，染毒剂量为0.003 9、0.007 8 mg/ml，对照组加入相同体积的生理盐水（空白对照）或低浓度HNO3（HNO3对照）。以后隔天换液，一周后加入矿化诱导液（含50 μg/ml Ascorbic Acid，10 mmol/L Na-β-glycerol-phosphate），第20天用95% 乙醇原位固定30 min，0.2% 茜素红（ARS）进行矿化结节染色并计算面积，以mm2/视野表示。结果与空白对照和HNO3对照比较 1.3 统计分析 应用SPSS 11.5软件进行统计分析，组间比较采用one-way ANOVA分析，LSD法进行组间两两比较。数据统计结果均用x±s表示，P 0.05）。染毒后48、72 h，均对OB的增殖有明显抑制作用，且随着染毒剂量的增高、染毒时间的延长，抑制作用增强。其中48 h时间点的OB增殖抑制率达3.8%～21.0%，72 h时间点达15.2%～59.0%。与对照组相比，0.007 8 mg/ml以上剂量DU染毒48 h后、0.001 9 mg/ml以上剂量DU染毒72 h后，对OB增殖率的抑制作用均有显著意义（P 0.05）。因此，DU可明显抑制OB的增殖，并与染毒剂量和时间有关，见表1 2.3 贫铀对ALP活性的影响 不同剂量和时间的DU染毒组细胞ALP活性均较对照组有明显下降。与对照组相比，DU染毒后24 h OB的ALP活性下降5.0% ～ 57.7%，其中0.003 9 mg/ml及以上剂量DU，对OB的ALP活性的抑制作用有显著意义（P 0.05），见表2。证明DU染毒能明