生物制药学——第五章 固相析出分离法.ppt

两性电解质，静电力作用，相互排斥； 形成水化膜，避免相互碰撞。 （3）盐析过程 蛋白质在水中的溶解度与离子强度的关系 Cohn经验公式： lgS = β- Ks μ S — 蛋白质溶解度，g / L； μ — 盐离子强度， μ = ? Σci Zi 2， ci — 盐离子强度，mol / L； Z i — i 离子化合价； β— 常数； Ks — 盐析常数。 Ks盐析法（溶解度剧烈下降） 在一定的pH和温度下，改变盐离子强度（浓度）进行盐析 分辨率不高 用于提取液的前期分离 β盐析法（溶解度变化缓慢） 一定的盐离子强度下，改变pH和温度进行盐析 分辨率比Ks盐析法高 用于后期分离 a、盐析作用规律 半径小的高价离子作用较强，半径大的低价离子作用较弱（感胶离子序）。 b、用盐的参考要求 盐析作用要强 较大的溶解度，受温度影响小 必须是惰性的 来源丰富、经济 c、硫酸铵特点 优点：价廉，溶解度大（767g/L），随温度变化小 缺点：水解变酸；高pH释氨，腐蚀；残留量对产品有影响。 硫酸铵使用注意事项: 1、硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前用H2S处理. 2、高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水调节至所需PH。 3、硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意。 2）溶质（蛋白质等）种类 蛋白质种类不同（β和 Ks不同）， 盐析沉淀所需的无机盐量也不同。 先后加入不同量的无机盐可分级沉淀不同蛋白质。 3）蛋白质浓度的影响 蛋白质浓度大，盐的用量小，共沉作用明显，分辨率低； 蛋白质浓度小，盐的用量大，共沉作用小、分辨率高 适当稀释，可使盐析分布曲线互相重叠的两个蛋白质分级沉淀。 一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降。 必须考虑到蛋白质对热稳定性。 α- 淀粉酶、蛋白酶 影响蛋白质表面净电荷的数量。 通常调整体系pH值使其在pI附近；且pr稳定性好。 在高盐溶液中蛋白质等电点的偏移现象。 （2）直接加固体硫酸铵 2.盐析方法和注意事项 1）分级盐析法 2）重复盐析法：用较低的盐饱和度多次重复盐析。 3）反抽提法：先共沉淀，再用稀盐溶去杂蛋白。 3）盐析注意事项 沉淀反应在缓冲溶液中进行； 盐析完全需要一定时间； 能否多次盐析靠试验确定； 盐析后应及时脱盐（常用透析）。 选择原则： 水溶性要好（与水无限混溶） 介电常数要小 致变性作用要小 毒性要小、挥发性适中 举例：固体发酵生产α-淀粉酶的提取工艺研究 α-淀粉酶（米曲霉）菌体 + 水 过滤 水抽提清液  加乙醇（70%）搅拌 α-淀粉酶↓ * pH影响 收率% 酶活 收率 酶活 6.5 pH * 适宜的pH 5.6 ~ 6.0 * 温度影响 收率% 酶活 酶活 收率 10 20 T℃ * 适宜的温度10 ~ 20 ℃ 有机溶剂沉淀实例 第三节 其他沉淀方法 1.等电点沉淀 调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀。 原理： 蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层破坏和水化膜变薄，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。 操作时的注意事项： （1）由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“漂移”，阳-高，阴-低 （2）溶质的稳定性 （3）由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，因此等电点沉淀法通常与盐析、有