第3章 高效液相色谱分析法 hplc.ppt

Instrumental Analysis 化学化工学院 第3章 高效液相色谱分析法 HPLC （High Pertormance Liquid Chromatography）3-1 高效液相色谱法的特点 一、高效液相色谱法特点 高效液相色谱法特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350×105 Pa高速：一般在1h内完成 高效：大于30000塔板/米高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）二、HPLC与GC差别1．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测占有机物的20%。 HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测。用途广泛，占有机物的80%。2．流动相差别的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。3．操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 3-2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 理论与气相色谱一致。一、塔板理论 二、速率理论（与GC对比）1、 2、讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比） 2）涡流扩散项及其影响 3）纵向扩散项 分子在液相中的扩散系数比气相中要小4-5个数量级，当流动相的线速度大于 0.5 cm/s时，此项可以忽略。4）传质阻力项及其影响  （1）固定相传质阻力项 （2）流动相传质阻力项 ①流动的流动相传质阻力项 ②滞留的流动相传质阻力项 结论：1、提高柱效，必须提高柱内填料装填的均匀性和减小粒度以加快传质速率。2、液相色谱的柱效比气相高的多，且流速比GC流速小近一个数量级。3、HPLC还要主意柱外展宽，包括柱前扩展和柱后扩展，前者主要是由进样所引起，后者主要是由连接管、检测器流通池体积所引起。 3-3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理1.液液分配色谱法（LLC）及化学键合固定相色谱（CBC）（1）分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异（2）固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液——极性 固定液——非极性 （3）正相色谱——固定液极性 流动相极性 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分。 反相色谱——固定液极性 流动相极性 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分。 （一）常规化学键合相 利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面。（1）分离机制：分配 + 吸附（以LLC为基础） （2）特点： 不易流失 热稳定性好 化学性能好 载样量大 适于梯度洗脱2、液固吸附色谱法（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂。 （1）分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异 　　　分离前提：K不等或k不等 （2）固定相：与LC比，固定相粒径不同（10μm） 　Ｂ、高分子多孔小球：YSG 原理：吸附+分配 蒹小孔凝胶作用 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物 （3）流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂  例： 正己烷或庚烷 + 氯仿 （4）影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑ 溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓， tR↓注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间（5）出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出