第一部蛋白质化学 生物化学课件.ppt

① 酶解法 一些内肽酶进行选择性降解。 蛋白质的分离、纯化与鉴定 （一）蛋白质分子量的测定 （1）根据化学组成测定最低分子量 （4）利用凝胶过滤测定分子量 凝胶过滤：也称凝胶层析、分子筛层析， 它是依据样品物质分子大小这一物理性质进行分离分析的方法。 分子筛效应：不同大小的分子在网状凝胶中，大分子走的路径短、小分子走的路径长。 凝胶的类型 葡聚糖凝胶 单体：1，6 - 糖苷键连接的葡聚糖 交联剂：1-氯-2.3-环氧丙烷 交联度：1g葡聚糖凝胶所用交联剂的克数。 决定凝胶孔径大小 成反比 筛目： 凝胶颗粒的大小的标准，成反比。 常用100-200目 Sephadex-G25 Sephadex-G50 应用： 1.浓缩和脱盐用小孔径的凝胶 2. 纯化需要G75以上的凝胶 （5）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量 （二）蛋白质混合物的分离方法（蛋白质纯化方法） 根据分子大小不同的分离方法 1.透析和超滤 （1）透析：Dialysis 此法是利用蛋白质分子不能透过半透膜，而使它与其它小分子化合物，如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活性剂等分离。 常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料，截止分子量一般为一万。  3.凝胶过滤 同前 利用溶解度的差异的分离方法 1.等电点沉淀和pH控制 蛋白质在等电点溶解度最小 （2）盐溶 低浓度盐时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称盐溶。 盐离子减弱了蛋白质之间的相互作用。 根据电荷不同的分离方法 1.电泳： 外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）早在1959年由Raymends 和Weintraub,L建立。 由于它具有较高的分辨率和灵活性，目前已被广泛应用于蛋白质等生物大分子的分离分析中。 （2）凯氏定氮法的优缺点 优点：适用于一切形态的样品，无论是固体还是液体都可以获得精确的分析结果。尤其是当样品溶液浑浊时，用其他方法不能进行蛋白质含量分析。而采用凯氏定氮法仍能可以获得可靠的结果。 缺点：样品中存在非蛋白氮对测定值有直接影响，测定前需除去；在构成蛋白质的氨基酸有偏差时，造成测定误差；操作过程繁琐，对操作者的技术熟练程度要求高。 2.双缩脲法测定蛋白质含量 3. Lowry法 4.紫外光吸收法 （1）原理：蛋白质中的芳香族氨基酸的共轭双键，使蛋白质在280nm有一个吸收峰，可根据吸收值推算蛋白质含量。 相对纯化的、无核酸污染的蛋白质的紫外吸收比值（A280/A260）约为1.8，如此值过低，表明有较多的的核酸杂质存在。 （2）紫外光吸收法的优缺点 优点：简便，样品不损失，测定后可继续使用。 缺点：精确度差。 （3）用途 在蛋白质纯化过程，尤其是各种色谱纯化过程中监测蛋白质的位置，判断吸附和洗脱情况。 5.考马斯亮蓝染色法 （1）原理：考马斯亮蓝G-250在一定浓度的乙醇和酸性溶液中，呈现红色。在此溶液下，考马斯亮蓝G-250可以与蛋白质结合，并导致考马斯亮蓝G-250的颜色从红色变为兰色，最大吸收峰从465nm移至595nm。考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的复合物在595nm波长处具有很高的光吸收，并与溶液中的蛋白质浓度呈正比。 （2）考马斯亮蓝染色法的优缺点 优点：操作简便；灵敏度高于Lowry法；考马斯亮蓝G-250与蛋白质 的复合物颜色稳定。 缺点：要求样品完全溶解；样品不能回收使用。 （二）其他蛋白质定性定量分析技术 免疫印迹法（Western blotting）是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白的定性方法，也可以作为确定同一种蛋白质在不同细胞或同一细胞不同条件下的相对含量的半定量方法。印迹技术最初是用于核酸的分子检测，后来人们发现，蛋白质在电泳分离之后也可以转移并固定与膜上，相对应于 DNA的Southern blotting 和RNA的Northern blotting ,该印迹方法亦被称为Western blotting。由于蛋白质常用抗体来检测，因此也被称为免疫印迹技术（immunoblotting ）。 蛋白质的定性定量分析 （一）蛋白质的含量测定 1.凯氏定氮法： （1）原理：基于蛋白质的含氮量通常在16%。 用凯氏蒸馏装置将氨收集到无机酸中，用标准碱溶液进行滴定确定氨量，根据氨量计算出样品的含氮量，进而计算出蛋白质的含量。 消化装置 蒸馏装置 Sephade