第三章高效液相色谱分析-64学时.ppt

第三章　高效液相色谱分析法 主要内容 3-1 HPLC的发展 3-2 HPLCE与经典液相色谱法和GC的差异 3-3液相色谱法的原理和特点 3-4高效液相色谱的分类和原理 3-5液相色谱仪 3-6液相色谱的固定相与流动相 3-7影响分离的因素与操作条件的选择 3-1 HPLC的发展 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC) 现代液相色谱 现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。 3-2 HPLCE与经典液相色谱法和GC的差异 1．高效液相色谱法与经典液相色谱法 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cm·min-1. 对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分. 　　　气相色谱法对挥发性样品是非常有效的分离方法．但是，对分子量超过300的组分及热分解产品都不适用．由于样品在工作温度下必须汽化这个特点限制了它的应用．为此，人们不得不通过柱前衍生法使样品能够汽化，这样大大加重了分析前处理的复杂性和数据的准确性． 　　　而高效液相色谱只需要样品能制成溶液，不需汽化，不受样品挥发性的限制．特别适用于高分子化合物，易热降解的物质及生物活性物质的分离，因此应用面比气相色谱要高得多． 总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。 3-3液相色谱法的原理和特点 液相色谱分离原理 原理： 被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子（溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。 液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂 液相色谱分离原理 根据分离机制不同，液相色谱可分为： 液固吸附色谱 液液分配色谱 化合键合色谱 离子交换色谱 分子排阻色谱等类型 特点： 高压——压力可达150～350 x105Pa。色谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。 高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 色谱柱可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。  3-4高效液相色谱的分类和原理 1、液-固吸附色谱 固定相：与LC比，固定相粒径不同（<10μm） 流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿- - - 1．影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑ 溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓， tR↓ 注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间 2．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱 3．硅胶吸水量↑，LSC→LLC 硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大 硅胶含水量>17% 分配色谱 硅胶失活→载体