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实用指导（二）：慢病毒感染贴壁细胞实验步骤 和元生物 | 2016-03-15 13:51 慢病毒慢病毒（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体 ，基因组为 RNA， 对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒基因组进入细胞后 ，在细胞浆中反转录为 DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的 DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因 表达或小 RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。 以24孔为例： 第一天 ：准备细胞将状态良好的目的细胞接种到24孔板中 ，细胞计数后 ，进行铺板 ，每孔 加入 500ul 培养基。保证第二天感染病毒时融合效率达到30-40%。通常，24孔板内以 5-8*10^4cells/孔的密度铺板。 第二天：病毒感染，换液1计算病毒加药量 选择合适 MOI值，进行病毒感染。 加药量计算方法： （细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×10^3=病毒加药量（μl）。 2弃去部分培养基 将每组中加入的病毒及感染增强剂的体积去掉 ，保证加入病毒和感染增强剂后 ，每孔中仍保 持500ul的液体量。 3加入慢病毒加药量计算方法 （细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×10^3=病毒加药量（μl），培养基的总量必须充分覆 盖住细胞。 4添加感染增强剂polybrene, 保证终浓度为5ug/ml Polybrene 是一种聚阳离子 ，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为 2-10 μg/ml）。过长时间暴 露于 Polybrene（12 小时）可对某些细胞产生毒性作用。 5病毒感染8~12小时后，观察细胞状态。 如细胞状态差 ，尽快换新鲜培养基 ；如细胞状态良好 ，可以在24小时内换液 ，但不宜超过 24小时。弃去培养基后每孔加入500μl新鲜的完全培养基。5%CO2培养箱培养。 第五天：观察荧光表达情况病毒感染细胞72h后，在荧光显微镜下观察细胞，估计慢病毒 感染目的细胞的效率。若荧光弱 ，可到96h后观察。如果96h仍无荧光 ，即感染实验失败。