SR-SIM超分辨率结构照明镜显微镜系统操作手册.DOC

SR-SIM超分辨率结构照明镜显微镜系统操作手册 SR-SIM原理： 结构照明是一个宽视场技术，其中，受栅格图案的衍射级的干扰，产生通过在拍摄图像的同时叠加在样品上，栅格图案被捕获的每个图像组在步骤之间的移动或旋转。高频信息用反傅里叶算法处理之后，可以从原始数据中提取以产生一个重建的图像，横向分辨率大约提高两倍，衍射限制范围在150和300纳米之间的轴向分辨率。 SR-SIM超高分辨率显微镜开机步骤： 注意：所有带三角警示标记的保育器开口都要关紧，避免激光照射！ Zeiss SR-SIM镜头配有10X/dry、63X/1.46Oil、63X/1.57Oil、100X/1.57Oil ELYRA S.1 软件基本操作流程 SR-SIM Workflow-Acqisition（图像获取） 目镜找视野 图像获取 注意：通常405nm的激光需设置较高的参数！ 获取三维图像 2.SR-SIM Workflow – Processing（图像处理） 3.最亮点投影 此时得到的图片为不同z轴上最亮点的投影。 Zeiss ELYRA S1 通道校正（Channel Alignment）操作流程 Acquire：使用200nm荧光小球获取SIM图像 Process：SIM图像处理 Process：Channel Alignment通道校正 Use：使用校正结果 样品为具有四种荧光通道、200nm直径的标准荧光小球。有以下两个样片： 样品编号 所匹配的物镜 0000-1783-455 63X/1.4 Oil，100X/1.46 Oil 0000-1788-601 100X/1.57 Oil 注意： 物镜及样片需要仔细清洗！ 在实验前。需将样品放置在开启的系统中稳定30分钟至60分钟。 需使用与物镜折射率相匹配的镜油。 具体操作流程见下图： Acquire SIM Image 获取SIM图像 使用200nm的荧光小球 2.生成SIM图像 3.通道校正 注意：在校正完成之后，请立即保存结果！ 4．如何保存校正表格 点击Apply后出现下列表格 注意：出现表格后立即保存，系统不会自动保存！ 如何使用校正结果 取消钩之后会出现新的表格 2 2.打开前部绿色电源 1.将UPS后部电源往上扳 5.打开载物台电源 4.打开显微镜电源 6.打开汞灯开关 3.打开两个拖线板电源 7.打开电脑 4.观察完毕后点击Oculars offline 1.选择Locate选项卡 2.选择Oculars online 3.选择BF（明场）或者Fset77（荧光） Fset77为双色滤片，能同时观察488nm，561nm 2.选择需要的rotation ，一般选5次 1.选择需要的图像分辨率 10.温度提示为红色时，仪器不能使用。等仪器降至相应温度方可使用 9.如有多通道可通过点击加号增加通道，每个通道重复步骤1-8 8.选择相应的伪彩 4. EMCCD增益(EMCCD Gain)为40，并在此基础上调节 3. 曝光时间为100ms，并在此基础上调节 2.通常设置激光强度为2，并在此基础上调节 1.选择相应的激发波长 6.在勾选所需要的激光波长之后，系统会自动选择最佳的光栅（基于所选择的物镜和激发光） 使用者仍可以手动改变所需的光栅 5. 点击SIM选项卡 7. 手动选择所需的滤片（系统不会自动选择） 10.点击Continuous进行预览并调节参数 11.点击Snap进行单张图片活图 1.选择Center 6.选择需要的张数，一般为10-21张 5.点击Smallest数值 4.点击Interval 2.将图像调节至焦平面，点击Center 3.点击向下箭头 7.点击Start Experiment开始获图 1.点击Processing 2. 选择Structured Illumination, 点击右边的小三角，以展开条目. 选择Structured Illumination 3.选择需要处理的SIM图像 4.点击Select 7.点击Apply 6.选择SR-SIM+Wild field 5.点击Automatic 4.点击Apply 3.点击Select 1.点击Maximum intensity projection 2.点击需要处理的图像 6.EMCCD Gain：30-50 4.激光强度：488nm，561nm：2-5%;405nm，642nm：4-10% 5.Exposure time：100ms 3. 建议案顺序依次设置642-561-488-405 2.选择5 rotation 1.选择需要的物镜