一、聚合酶链反应（PCR）.PDF

授课对象：11 级检验1-5 班 课 时：4 学时 一、聚合酶链反应 （PCR ） 【实验目的】 掌握聚合酶链反应技术 【实验用品】 10×Buffer 、primer Ⅰ、primer Ⅱ、dNTP 、Tag 酶、ddH O 、30mmol/lMgCl 、 2 2 DNA。 【实验原理】 PCR 实际上是一个在模板DNA 、引物 （模板片段两端的已知序列）和四种 脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA 聚合酶依赖的酶促合成反应，扩增的特异性 取决于引物与模板DNA 的特异结合。整个扩增过程分三步：①变性：加热使模 板DNA 双链间的氢键断裂而形成两条单链；②退火：突然降温后模板DNA 与 引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高 浓度、结构简单等特点，主要的结合发生在模板与引物之间；③延伸：在 DNA 聚合酶及镁离子等存在的条件下，从引物的3′端开始，结合单核苷酸，形成与模 板链互补的新DNA 链。上述三步为一个循环，从理论上讲，每经过一个循环， 样本中的DNA 量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过 6 9 25 ～30 个循环后DNA 可扩增10 ～10 倍。 【反应体系】（50μl ）： 10×Buffer 5μl Primer Ⅰ 5μl primer Ⅱ 5μl dNTP 5μl Tag 酶 2μl ddH O 21μl 2 30mmol MgCl 3μl 2 DNA 4μl 【程序】 ① 95 5min ② 94 ℃ 30s ③ 55℃ 40s ④ 72 ℃ 45s ⑤ goto②， cyce34 次 ⑥ 72 ℃ 7min ⑦ end 二、琼脂糖凝胶电泳 【实验目的】 掌握琼脂糖凝胶电泳技术。 【实验用品】 溴乙锭 （10mg/ml ），1%琼脂糖，电泳仪，电泳槽，紫外透射仪或凝胶自动 成像仪等。 【实验原理】 核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中 （PH8.0~8.3 ）， 其碱基不解离，而磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动，采用琼脂糖 凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子 泳动率出现较大差异，达到分离目的。此外，直接用低浓度的荧光嵌入染料溴乙 锭进行染色，可确定DNA 在凝胶中的位置，少至 1— 10ng 的DNA 条带即可直 接在紫外灯下检出。 【操作步骤】 1．选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与负 极的线路。 2．用胶纸将槽板两端封住，形成一个胶膜，将胶膜放在工作台的水平位置 上。选择孔径大小适宜的梳板。在距离胶膜底版1mm 处放置梳板。 3． 配制 1%的琼脂糖凝胶：准确称量 1g 琼脂糖凝胶，溶于 100ml 电泳 缓冲液0.5×TBE 中，加热溶解待溶液冷却至60℃，加入溴乙锭5μl （10mg/ml ）