农杆菌介导氮高效利用转基因水稻植株获得.doc

农杆菌介导氮高效利用转基因水稻植株获得摘要：将从深海硅藻中克隆的与氮具有高度亲和性的硝酸盐转运蛋白基因ＮＡＴ３通过农杆菌介导的遗传转化方法，转入水稻品种中花１１，在含３０ ｍｇ／Ｌ Bａｓｔａ的选择培养基上筛选，获得４５６棵抗性植株，对ＮＡＴ３目标基因检测，获得３１３棵阳性植株，初步证明目标基因已整合到中花１１基因组中 关键词：转基因水稻；硝酸盐转运蛋白；氮高效利用 中图分类号：Ｓ５１１；Ｑ７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）24－5247-03 Transgenic High N Use Efficiency Rice Obtained by Agrobacterium tumefaciens ＺＨＡ Ｚｈｏｎｇ－ｐｉｎｇ，ＷＡＮ Ｂｉｎｇ－ｌｉａｎｇ，ＹＩＮ Ｄｅ－ｓｕｏ，ＤＵ Ｘｕｅ－ｓｈｕ，ＱＩ Ｈｕａ－ｘｉｏｎｇ （Ｆｏｏｄ Ｃｒｏｐｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＮＡＴ３ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｎｉｔｒａｔｅ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ ｗａｓ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｉｎｔｏ ｒｉｃｅ ｚｈｏｎｇｈｕａ １１ ｖｉａ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． ４５６ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ３０ ｍｇ／Ｌ ｂａｓｔａ． ３１３ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｇａｉｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｔ ＮＡＴ３ ｇｅｎｅ． Ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔ ＮＡＴ３ ｇｅｎｅ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｚｈｏｎｇｈｕａ １１． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： transgenic ｒｉｃｅ； ｎｉｔｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ； ｈｉｇｈ Ｎ ｕｓｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ 植物的生长需要合适的氮量，氮是限制植物生长的重要因素［１］。硝酸盐（ＮＯ３－）是植物主要氮源之一，硝酸盐供应量的不足经常成为限制作物生长的因素［２－４］。但过量硝酸盐如果没有被植物吸收，极易通过淋失、渗透等途径转移到水环境中，造成水体硝酸盐污染的潜在危险，对生态环境和人体健康产生极为不利的影响［５］。氮肥施用量对晚稻产量和氮肥利用效率有影响，采用氮素运筹可影响免耕移植水稻产量及氮素利用率［6，7］。因此，提高氮肥的利用效率，对于促进氮肥的高效利用和减轻环境污染具有重要的意义。水稻是最早通过基因工程手段进行品种改良的作物之一，我国的转基因生物新品种培育重大专项也已实施，但提高水稻氮素利用率，培育氮高效利用的转基因水稻研究方面的研究不多［8］，因此迫切需要利用新的基因工程策略，培育氮高效利用的转基因水稻新种质 该研究通过农杆菌介导的遗传转化方法，将从深海硅藻中克隆的与氮具有高度亲和性的硝酸盐转运蛋白基因ＮＡＴ３导入中花１１中，旨在培育氮肥高效利用的转基因水稻，减少氮肥施用量，节约水稻生产成本，从而降低环境污染，促进农业高效节能、可持续发展 １ 材料与方法 １．１ 材料 用于研究的水稻材料为中花１１，植物表达载体由中国农业科学院生物技术所刘昱辉博士惠赠，根癌农杆菌菌株为ＥＨＡ１０５ １．２ 方法 1.2.1 水稻胚性愈伤组织的获得 将成熟种子剥壳后放在５０或１００ ｍＬ三角瓶中进行常规消毒，接种于诱导培养基中，每皿约３５～４０粒，封口膜封好后于２８ ℃暗培养 １．2.2 农杆菌介导的遗传转化 农杆菌在ＬＡ培养基上２８ ℃培养2 d后，用药勺刮取少量菌斑悬浮于含有１００ μｍｏｌ／Ｌ的乙酰丁香酮的ＬＢ培养基，调整菌液浓度至ＯＤ６００nm＝０．６左右。将经过预培养的水稻成熟胚诱导的胚性愈伤组织置于农杆菌悬浮液中，略微摇动后静置５ ｍｉｎ，然后将愈伤组织置于培养皿中无菌滤纸上，在超净工作台中吹干。最后将愈伤组织转入添加有１００ μｍｏｌ／Ｌ的乙酰丁香酮的共培养基上，１８ ℃暗培养３ ｄ １．2.3 抗性愈伤组织的筛选 待愈伤组织共培养２～３ ｄ，取出愈伤组织，用无菌水冲洗３～５次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。然后用含２５０ ｍｇ／Ｌ羧苄青霉素的无菌水再清