第五章色谱法-1研究.ppt

第五章 高效液相色谱法（HPLC） 主要内容 第一部分：液相色谱分离原理 第二部分：液相色谱条件优化 第三部分：维护及常见问题 正相液相色谱 键合相色谱 氢键力 流出顺序 影响HPLC分离的反相条件 主要内容 第一部分：液相色谱分离原理 第二部分：液相色谱条件优化 第三部分：维护及常见问题 总结—分离度的改善 等浓度洗脱系统 主要内容 第一部分：液相色谱分离原理 第二部分：液相色谱条件优化 第三部分：维护及常见问题 日常使用需注意 作业 在硅胶柱上，用甲苯为流动相时，某溶质的保留时间为25min。若改用四氯化碳或三氯甲烷为流动相，哪一种溶剂能减小该溶质的保留时间？ 指出下列物质在正相色谱和反相色谱中的洗脱顺序。（1）正己烷，正己醇，苯；（2）乙酸乙酯，乙醚，硝基丁烷。 自学内容 原子荧光光谱法 ICP-MS The end! 分析方法的开发 分析时要了解哪方面的情况？ 灵敏度的要求有多高？ 样品的本底是否很复杂？ 有多少组分要分析？ 对分析的精确度、准确度等有多高要求？ 是否因是日常检验而要求方法容易使用？ 要分离的样品量有多大？ 要分离的组分在样品中的含量很高还是微量？ 是否需要保持生物活性？ 对分离产物纯度的要求有多高？ 纯度和活性的鉴定如何完成？ 分析方法的开发 一般的具体步骤 先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 调节 k 值改变保留值 调节 a 值改变选择性 调节柱长度改变柱效及分离速度 请记住每次改变一个参数 。 残留硅羟基 残留的重金属 液 相 色 谱 分 析 开发液相色谱分析方法 分辨率是色谱分析中主要考虑的因素。 在开发色谱方法时，有很多因素是很重要的。除分辨率 之外，以下因素都要考虑。 1.灵敏度 5.成本 2.载样量 6.容易使用 3.分析速度 7.色谱柱寿命 4.溶剂消耗 8.效率 液相色谱分析方法的建立 （1）分子量：在样品预处理或GPC分析时有用； （2）选择合适的液相色谱方法（正相、反相或其他）； （3）选择合适的色谱柱； （4）溶解度：选择流动相的条件； （5）官能团：有否离子化基团？保留特性如何？ （6）样品的基质：考虑是否要前处理，如何前处理； （7）选择合适的K’值的条件； （8）选择良好的峰位（a值）； （9）选择良好的色谱柱条件（N值）； （10）检测特性：是否有紫外吸收？荧光？ （11）用实测样品解决出现的特殊问题； （12）证实方法的正确性。 当反相或离子对HPLC无效时的第二个较好选择；首选为不溶于水/有机混合液的亲脂样品，异构体混合物和制备HPLC 硅胶最好 流动相：有机溶剂混合液 色谱柱：氰基，二醇基，氨基，硅胶 正相 HPLC 离子或可电离化合物，尤其是碱性或阳离子化合物的良好选择 流动相：水/有机溶剂（一种缓冲物控制pＨ和离子对试剂） 色谱柱：C18（ODS），C8，氰基 离子对 HPLC 首选为能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物。 流动相：水/有机溶剂 色谱柱：C18（ODS），C8，苯基，三甲基硅烷，氰基 反相 HPLC 何时应用该方法 样品特点/色谱柱 方法 选择液相色谱的方法 主 要 液 相 色 谱 方 法 特 性 用于分离蛋白质 流动相：盐溶液 色谱柱：类似于反相填料，但疏水性小得多 疏水作用 色谱法 分离大分子样品，如蛋白质和人造聚合物的良好首选，也可用于测量分子量的分布 流动相：水相（GFC）或有机相（GPC） 色谱柱：GFC用二醇基，GPC用聚苯乙烯或硅胶，孔径大小支配分子量范围 体积排阻 色谱法 分离无机离子混合物的首选（离子色谱法）；分离蛋白质、核酸样品及有关化合物的良好选择 流动相：水相，另以缓冲物控制pH 色谱柱：阳离子或阴离子交换 离子交换 色谱法 何时应用该方法 描述/色谱柱 方法 选择液相色谱的方法 次 要 液 相 色 谱 方 法 特 性 峰 位 的 重 排 在分析多组分样品时，仅改变流动相的强度（组成百分比） 而不改变其组成，一般仅仅改变所有组分的tR，不会发生峰 位重排。在反相色谱中，下列条件改变可能发生峰位重排： （1）流动相中换了强溶剂种类； （2）pH值的改变； （3）柱填料的改变； （4）柱温的改变； （5）流动相组成的改变（如加入离子对试剂三乙基胺等） 分析方法的开发 第一步干什么？ 想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法； 查文献，各种手册，如药典、农药手册以及国家标准； 向仪器制造商询问。 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法。 充分了解