钙激活氯离子通道在气道杯状细胞合成黏蛋白中的促进作用论文.docVIP

　　钙激活氯离子通道在气道杯状细胞合成黏蛋白中的促进作用论文 宋立强，戚好文，李妍，王吉村，林爱华 【关键词】 杯状细胞 【Abstract】 AIM: To investigate the effects of human calciumactivated chloride channel 1 (hCLCA1) on synthesis of mucin in airid pIRES2EFGP/hCLCA1, id odel in vitro. Transfected NCIH292/hCLCA1 cells icroscopy and hCLCA1 mRNA etry. The expression of mucin MUC5AC protein and mRNA ined ucin protein expression and mRNA level of NCIH292/hCLCA1 cells arkedly inhibited the above changes of NCIH292/hCLCA1 cells. CONCLUSION: hCLCA1 promotes the proliferation and mucin synthesis in airay be a potential treatment for asthma. 【Keya; airRNA. 根据NFA（hCLCA1阻断剂）干预与否.freelRNA水平. 结果： 经过500g/L的G418筛选，证实获得NCIH292/hCLCA1细胞. 对各组细胞检测结果表明，NCIH292/hCLCA1细胞的增殖活性、黏液糖蛋白表达量及MUC5AC mRNA水平均显著高于亲本细胞，并且NFA能有效抑制NCIH292/hCLCA1的这些生物活性改变. 结论： hCLCA1能有效促进气道杯状细胞的增殖能力及黏蛋白合成，早期阻断hCLCA1可能是哮喘防治的有效途径之一. 【关键词】 哮喘；气道；上皮细胞；杯状细胞；氯化物通道 0引言 气道上皮杯状细胞增生及伴随的黏蛋白高分泌是哮喘的主要病理特点之一，并已成为病情加重的指征［1］. 杯状细胞产生的黏蛋白MUC5AC被认为是该细胞增生的标志［2］. NCIH292是一种人气道黏液上皮细胞系，能产生多种黏蛋白，常被作为杯状细胞功能特点研究的体外模型［3］. Hoshino等［4］和Toda等［5］相继证实，哮喘患者气道杯状细胞的人钙激活Cl通道I型（human calciumactivated chloride channel, hCLCA1）高表达. hCLCA1属于一种新近发现的跨膜阴离子通道家族，一般认为该家族与胞膜转运水和电解质的功能相关. 我们拟利用体外培养NCIH292细胞，探讨hCLCA1与黏蛋白合成的关系. 1材料和方法 1.1材料 人气道黏液上皮细胞系NCIH292(西京医院呼吸内科实验室保存)；pcDNA3.1(+)/hCLCA1质粒(美国Levitt RC教授惠赠)；CLCA阻断剂NFA（niflumic acid）(Sigma公司)；大肠杆菌JM109及真核表达载体pIRES2EGFP（具有双顺反子）（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室）；γTaq DNA多聚酶、T4 DNA连接酶及限制性内切酶NheⅠ, XholⅠ （TaKaRa公司）；RevertAidTM逆转录试剂盒（Fermentas公司）. 1.2方法 1.2.1pIRES2EGFP/hCLCA1表达质粒的构建采用NheⅠ和XholⅠ从质粒pcDNA3.1(+)/hCLCA1中切出hCLCA1基因片段，将其亚克隆入相同酶切的载体pIRES2EGFP，重组质粒命名为pIRES2EGFP/hCLCA1. 转染大肠杆菌JM109感受态细胞，铺板（含卡那霉素），挑克隆，酶切电泳鉴定. 测序鉴定由上海鼎安科技公司完成. 1.2.2细胞转染及筛选① 新霉素（G418）浓度的确定以细胞密度4×105 /孔将NCIH292细胞接种于24孔板中，采用含100 mL/L灭活小牛血清的DMEM进行培养，并分别加入梯度浓度G418（200, 300, 400, 500, 600, 700,.freelin，72℃延伸1 min； GAPDH循环参数： 94℃变性20 s， 59℃退火20 s， 72℃延伸20 s；均循环35次. 各PCR扩增产物行琼脂糖凝胶电泳鉴定. 1.2.4细胞分组根据NFA干预与否分成4组： ① NCIH292；② NCIH292+NFA,待细胞长至对数生长期，加入终浓度为100 mg/L的NFA干预24 h; ③ NCIH292/hCLCA1；④ NCIH292/hCLCA