青蒿琥酯诱导人胚肺成纤维细胞凋亡的分子机制研究论文.docVIP

　　青蒿琥酯诱导人胚肺成纤维细胞凋亡的分子机制研究论文 王昌明，张孝飞，黄岚珍，范才文，林云，徐青 【摘要】 目的研究青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞(HELF)系 HFL-I细胞株体外生长的影响，为青蒿琥酯抗纤维化提供实验依据。方法采用CCK-8法检测青蒿琥酯对体外培养的HFL-I细胞的生长抑制作用，用流式细胞术测定细胞凋亡率; RT-PCR法测定Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达。结果青蒿琥酯呈浓度依赖性抑制HFL-I细胞增殖.freelRNA的表达显著低于对照组，Bax mRNA的表达显著高于对照组。结论青蒿琥酯具有抗肺纤维化作用，可能机制为通过下调Bcl-2 mRNA和上调Bax mRNA表达抑制HFL-I细胞增殖，促进HFL-I细胞凋亡。 【关键词】 青蒿琥酯; 人胚肺成纤维细胞; 增殖; 凋亡; Bax; Bcl-2 肺纤维化是多种病因引起的一种慢性炎性间质性肺疾病，患者平均生存时间一般不超过3年，目前尚无有效治疗方法。近年研究发现，青蒿素类药物除可抗疟疾外，亦具有抗肿瘤、抗感染及抗纤维化等作用。2009-06～2009-11，我们观察了青蒿素衍生物青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞(Human embryonic lung fibroblast，HELF)系 HFL-I细胞增殖、凋亡的影响及机制，旨在为临床治疗肺纤维化提供理论依据。 1 材料 HFL-I细胞株(中国科学院细胞库提供)，青蒿琥酯(分析纯，纯度 99% ，广西桂林南药公司产品，批号ZA080203)，CCK-8试剂，二甲基亚砜(DMSO)，碘化丙啶(PI)，D-MEM/F-12培养基，FBS，胰酶;RNA提取试剂Trizol，反转录试剂盒PrimeScript TMRT reagent Kit，PCR试剂盒Premix PrimeSTAR HS，引物由上海生物工程有限公司合成。 2 方法 2.1 HFL-I细胞培养取 HFL-I细胞株，用含10% FBS、1×105U/L青霉素及100 mg/L链霉素的D-MEM/F-12培养液培养，37℃、5% CO2培养箱培养，3 d换液1次，5～6d传代1次。取4代以上细胞用于下列实验。 2.2 细胞增殖及细胞增殖抑制实验采用CCK-8法。取对数生长期 HFL-I细胞接种于96孔培养板中，每孔10 000个，12 h后分别加入浓度分别为2.5，5，10，20，40，80 mg/L的青蒿琥酯，对照组加入等体积培养液，每组设3个复孔，37℃、5%CO2饱和湿度下培养48 h，期间吸去培养液，PBS洗涤1次，加入含10% CCK-8溶液100 μl的无血清培养基，继续培养2 h后于450 nm处测定吸光度(A值)，并计算各组细胞抑制率。细胞抑制率(%)计算公式：(1 - 实验组A值/ 对照组A值) ×100 %。 2.3 细胞凋亡形态学观察HFL-I细胞调整浓度为1×106/ml种于6 cm皿中，待细胞完全贴壁后，经10 mg/L青蒿琥酯作用48h，进行Hochst33258染色，于荧光纤维镜下观察并摄像。 2.4 流式细胞数术检测细胞凋亡率 取对数生长期 HFL-I细胞，用含10% FBS的D-MEM/F-12培养液调整细胞浓度为1×106/ml，接种于25 cm2的培养瓶中，5% CO2、37℃培养箱中培养12 h至贴壁，用含0.5% FBS的D-MEM/F-12培养液培养24 h，使细胞周期同步化。加入浓度分别为1，10，100 mg/L的青蒿琥酯，对照组加入等体积培养液，每组设3个复孔，作用48 h后收集贴壁细胞，制成单细胞悬液，70%乙醇固定，4℃保存过夜，-20℃保存(有效期为1周)。检测前用PBS洗去固定液，加入20 μl RnaseA， 37℃孵育30 min，暗处加PI染液，冰浴30 min，染色后以300目筛网过滤。调整细胞浓度为1×105～6/ml后采用流式细胞仪，在波长488 nm下用Multicycle DNA分析软件行凋亡率测定，实验重复3次。 2.5 RT-PCR检测Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表达HFL-I细胞种于6孔板，细胞贴壁并长至80%丰度，换含2%血清培养基(D-MEM/F-12)培养12 h，后加入不同浓度的青蒿琥酯(1，10，100 mg/L)，设不加药物的阴性对照组，继续培养24 h后，用Trizol试剂提取高质量的mRNA。按照反转录试剂盒说明合成cDNA。PCR引物序列如下：人内参β-actin：上游引物5-AAGATCCTGACCGAGCGTGG-3，下游引物：5-CAGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3，扩增长度300bp， Bax上游引物：5-ATTGGAGATGAACTGGACAA-3，下游引物：5-CCACAAAGATGG