靶向survivin利用RNA干扰技术影响云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC凋亡的初步研究论文.docVIP

　　靶向survivin利用RNA干扰技术影响云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC凋亡的初步研究论文 蒋鸿超 ，孙茂盛，赵丹，吕琳，孙强明，李鸿钧 【摘要】 目的 检测云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC细胞内源凋亡抑制因子survivin基因的表达以及促进YTMLC细胞凋亡的情况。方法 构建和转染重组质粒pshRNAsurvivin1和pshRNAsurvivin2至YTMLC细胞株,通过免疫荧光和半定量RTPCR 检测survivin 蛋白表达及mRNA 转录水平的变化，并通过流式细胞仪使用PIAnnexin V双染法检测YTMLC细胞株的凋亡。结果 构建的2种重组质粒pshRNAsurvivin1和pshRNAsurvivin 2均能明显抑制survivin基因的表达;应用免疫荧光检测survivin基因的表达,转染重组质粒pshRNAsurvivin1和pshRNAsurvivin2的实验组survivin荧光强度明显低于转染空载体pGE1和pshRNAnegative非特异对照质粒;通过半定量RTPCR 检测到survivin基因mRNA转录明显减少,抑制率为80.60%和70.09%;通过PI Annexin V 双染法检测YTMLC细胞的凋亡分别达（33.42±2.42）%（P 0.01）和（20.09±1.32）%（P 0.01）。结论 重组质粒pshRNAsurvivin1和pshRNAsurvivin2 均可明显抑制YTMLC细胞内源survivin 的表达和mRNA 的转录均可并明显促进YTMLC细胞的凋亡,为survivin 介导的肿瘤基因沉寂疗法提供良好的实验基础。 【关键词】 siRNA 云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC survivin 基因;质粒;表达 Key ous carcinoma cells(YTMLC); survivin gene;Plasmid;Expression 0引言 survivin 是一类仅在肿瘤细胞中表达的凋亡抑制因子(Inhibitor of apoptosis,IAP),在肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用1。研究表明,抑制survivin基因的表达可介导肿瘤细胞的凋亡,进而抑制肿瘤的生长2。本实验选择和设计针对survivin编码基因的siRNA靶序列,通过人工合成靶序列后构建表达siRNA靶序列的载体，并转染云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC细胞,观察siRNA 能否诱导肿瘤细胞内源性survivin表达的沉默并介导肿瘤细胞的凋亡增加,为肿瘤的基因沉寂疗法提供实验基础。 1材料和方法 1.1材料与试剂 1.1.1质粒、菌株和细胞 siRNA表达质粒pGE1 和非特异对照质粒pshRNAnegative 购自Stratagene公司;大肠杆菌SCS1购自Stratagene公司。云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC细胞由本研究所保存。 1.1.2试剂 去内毒素质粒DNA小量提取试剂盒和小量DNA切胶回收纯化试剂盒.freelentas产品；内切酶、Taq酶、T4 DNA连接酶和DL2000 Marker购自TaKaRa 公司; 一抗为survivin兔IgG多抗(FL142)购自Santa Cruz 公司；二抗为FITC标记山羊抗兔IgG（H+L）购自北京中杉金桥公司;转染试剂LipofectamineTM 2000 购自Invitrogen 公司; PIAnnexin V双染试剂盒购自Immuntech公司;引物和寡聚核苷酸片段均由上海生工生物工程公司合成；DMSO、Tris碱和甘氨酸购自Sigma公司；细胞培养用RPMI1640购自Gibco/BRL公司；新生牛血清购自杭州四季青公司；其他试剂均为国产分析纯。 1.2方法 1.2.1靶向survivin的siRNA表达载体的靶序列的选择和合成 以人survivin（NM001168）为对象，根据RNA设计原则3和survivin编码序列,利用Stratagene公司和Invitrogene公司的在线设计程序siRNA 1.0分别设计19和29nt的DNA 片段各一,.freelation）同源序列检索确定与其他基因家族没有同源性后进行载体构建。根据上述结果分别合成两对针对survivin编码序列的正义和反义的寡聚核苷酸片段。具体序列如下：survivin1 siRNA (编码基因387bp405bp),5′ GAT CCC GAA AGT GCG CCG TGC CAT CTC AAG AGG ATG GCA CGG CGC ACT TTC TTT TTT 3′（正义）和5′CTA GAA AAA AGA AAG TGC GCC GTG CCA T