章跃陵- 蛋白质组学 - 生物化学与分子生物学 - 汕头大学.ppt

1、双向电泳 1）原理 Smithies和Poulik(1956)最早引入了二维电泳技术，他们将纸电泳相淀粉凝胶电泳结合来分离血清蛋白质。随后二维电泳技术经历了更多的发展，并将聚丙烯酰胺介质引入应用，特别是等电聚焦技术在一向的应用，使基于蛋白质电荷属性的一向分离成为可能。目前所应用的二维电泳体系是O’Farrell等首先于1975年发明，其原理是根据蛋白质的两个一级属性：等电点和相对分子质量的特异性，将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离(等电聚焦)，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS—PAGE)。 2）分辨力 在最好状态下，传统等电聚焦技术和SDS在20cm左右长度的凝胶中可在各自方向上分辨出100个不同的蛋白质条带，因此，理论上的二维电泳分辨能力可达到10 000个点。目前已有实验室在30cm x 40 cm的大胶上获得这一分离效果。考虑到大多数实验室并不具备运行这种大胶所需要的条件，普通情况下的凝胶(20 cm x 20 cm)分辨到3000个点已是相当不错。但利用特殊的样品制备方法如三步提取或亚细胞器提取，以及窄范围等电聚焦胶条，都可大大提高二维电泳的分辨能力。二维电泳分离后的蛋白质点经显色方法如考马斯亮蓝染色、银染、负性染色、荧光染色或放射性标记等染色处理后，通过图像扫描存档，最后呈现出来的是在二维方向排列的呈“满天星”状排列的小圆点，其中每一个点代表一个蛋白质. 2、图像分析与细胞蛋白谱的建立 1）必要性：要对上千个蛋白质点进行分析，只有依赖于双向电泳凝胶分析软件，完整的图像处理包括图像的采集和双向电泳图像分析(图): 2）常用图像采集系统 常用的图像采集系统有： 电感偶合装置(change coupled devices,CCD) 光密度扫描仪 激光诱导荧光检测器等。 图像采集注意事项 常用几类扫描仪的分辨率均可达到1000dpi(dot per inch)以上，但设置dpi值太大，图像保真度虽然提高了，而图像所占字节数也大大增加，使软件在分析图象时对处理器的要求提高了，这样就大大延长了运行时间。在实际应用时，仪器分辨率设置为300dpi、8bits深度为宜，此时一块20cm x 20cm的双向点泳胶(Protean II，Bio-Rad)保存为tif格式的文件后，约占用 6Mb 的字节空间，分辨率低于300dpi时会失去某些光密度信息，高于300dpi时，分析软件所能识别的图像光密度信息得不到多大改善，而图形文件大大加大。由于目前所用的凝胶分析软件只能识别256色的图像，要求在扫描时设定图像色彩为256色。 3、质谱分析技术 1）生物质谱技术的发展 质谱分析法是通过测定样品离子的质荷比(m/z)来进行成分和结构分析的分析方法。 自1886年Goldstein发明早期质谱仪器常用的离子源，到1942年第一台单聚焦质谱仪商品化，质谱基本上处于理论发展阶段。真正意义上的变革以80年代中期出现的两种新的电离技术：电喷雾电离和基质辅助激光解吸电离为代表，这两种技术所具有的高灵敏度和高质量检测范围，使得在fmol(10-15)乃至amol(10-18)水平检测相对分子质量高达几十万道尔顿的生物大分子成为可能，从而开拓了质谱学一个崭新的领域—生物质谱．促使质谱技术在生命科学领域获得广泛的应用和发展. ◆美日瑞三国科学家分享2002年诺贝尔化学奖 瑞典皇家科学院把２００２年诺贝尔化学奖授予美国科学家约翰·芬恩、日本科学家田中耕一和瑞士科学家库尔特·维特里希，以表彰他们发明了对生物大分子进行识别和结构分析的方法，其中芬恩和田中的贡献在于开发出了对生物大分子进行质谱分析的“软解吸附作用电离法”，维特里希的贡献是开发出了用来确定溶液中生物大分子三维结构的核磁共振技术。他们三人的这些研究成果对于研究包括蛋白质在内的大分子具有“革命性的”意义。?? 质谱分析是全世界各个化学实验室都在使用的一种非常重要的分析手段。以前，它只是用于小分子的分析研究。现在，由于芬恩和田中的发明，质谱分析也可以用于生物大分子的分析研究。利用芬恩１９８８年所公布的研究成果，研究人员可以获得电荷蛋白质液滴，并最终获得自由盘旋的蛋白质离子，通过使它们运动可以确定其质量，测出飞过指定距离所用的时间。同时，田中还发明了另一种可以造成蛋白质自由盘旋的技术——软激光解吸附作用技术。研究人员可以用这种技术把取样击成许多小块，迫使分子释放出来。 ? 2）质谱仪的基本组成 3）主要离子源 基质辅助激光解吸电离(Matrix-assisted laser desorption/ionization,