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植物病毒RNA沉默抑制因子的研究进展 报告人：赵淑玲 导 师：梁建生教授 * * RNA沉默的定义 RNA沉默是指由双链RNA（dsRNA）诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。 生物学现象来定义： 生物技术来定义： 人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。 RNA沉默是指由双链RNA（dsRNA）诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。 生物学现象来定义： 生物技术来定义： 人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。 RNA沉默是指由双链RNA（dsRNA）诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。 生物学现象来定义： 生物技术来定义： 人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。 基因沉默现象的发现 1990年，Jorgensen等将产生色素的基因导入矮牵牛中，试图加深花朵的颜色，结果很多花没有变成深紫色，反而成了花斑的甚至白的。表明不仅导入的基因未表达，而且本身同源的基因失活。从而发现在转基因植物中存在基因表达的共抑制现象，即转入的外源基因和本身的同源基因都被抑制，出现基因沉默现象。 父本 转基因后代 图1. GUS基因导入矮牵牛后的转基因植株 1998年Fire等证实，将制备的RNA高度纯化后发现，单链RNA的基因抑制作用很微弱，而用纯化后的dsRNA却能高效、特异地阻断相应基因的表达。实验证明双链RNA抑制基因的表达的效率比纯化后的反义RNA至少高几个数量 ，他们称此现象为dsRNA介导的RNA干扰（RNAi） Negative control uninjected Antisence RNA dsRNA dsRNA inject 图2. 原位杂交法检测不同RNA导入后线虫Mex-3基因产物的表达 dsRNA inject dsRNA inject dsRNA inject dsRNA RNA沉默的作用机制 dsRNA在Dicer酶的作用下，被切割加工成21~25nt的双链siRNA 激活的RISC将siRNA的双链解开，并通过碱基互补配对识别互补的mRNA，然后切割靶mRNA。 siRNA 结合一个酶复合物形成RISC 植物病毒编码的沉默抑制因子 RNA沉默抑制子的发现 1997年，马铃薯X病毒属与马铃薯Y 病毒属间的协同效应的研究发现马铃薯X病毒属编码的HC-Pro蛋白在协生中起致病增强的作用，HC-Pro蛋白可能充当RNA沉默的抑制子。1998年，三个独立的小组采用不同的方法证实了这一推测。 RNA沉默抑制子的作用机理 抑制病毒siRNA的产生 阻碍siRNA整合入 RISC 干扰RISC降解同源的mRNA 主要的三种作用方式 病毒沉默抑制子在siRNA和miRNA途径的作用目标 HC-Pro抑制RISC形成来抑制沉默 P19阻碍siRNA 整合入RISC CMV 2b干扰信号的长距离移动 P19阻碍siRNA 整合入RISC HC-Pro抑制RISC形成来抑制沉默 CMV 2b干扰信号的长距离移动 马铃薯Y病毒属编码的蛋白HC-Pro HC-Pro 可能抑制RISC形成 HC-Pro干扰siRNA的积累，在共浸润实验中减少了21nt和24nt siRNA的积累。转HC-Pro基因的植物中内源mRNA的积累增加，说明HC-Pro影响miRNA的功能和生物合成。因此，HC-Pro可能干扰了miRNA 和siRNA调控的一个共同反应，即抑制RISC的形成。 番茄丛矮病毒属编码的P19 P19 阻碍siRNA整合入RISC P19可结合siRNA双体，病毒侵染的植物中，病毒siRNA主要存在于P19复合体。 P19可能通过结合siRNA，使其不能整合入RISC来达到病毒侵染的目的。 并且P19抑制RNA沉默与蛋白质的积累量有关。 黄瓜花叶病毒属编码的2b蛋白 CMV 2b干扰沉默信号的长距离移动 转基因植物的杂交和嫁接试验表明， CMV 2b蛋白只能抑制系统沉默，推测其可能干扰信号的长距离移动。CMV 2b定位于核内，含一个核定位信号（NLS），而RNA沉默过程中目标mRNA的降解在细胞质内，因而2b可能与内源因子互作，影响系统沉默信号的多个过程。 沉默抑制子的主要鉴定方法 基因沉默的回复 用携带待鉴定基因的病毒载体接种报告基因已经发生沉默的转基因植物，观察病毒载体引起的症状是否加重和报告基因能否回复表达。 农杆菌浸润 GFP系统沉默 接种带有待鉴定基因的病毒载体 农杆菌浸润 农杆菌浸润 农杆菌浸润 接种带有待鉴定基因的病毒载体 农杆菌浸润 接种带有待鉴定基因的病毒