基于Hg2+诱导DNA双链形成荧光增强法检测 Hg2+.docVIP

基于Hg2+诱导DNA双链形成荧光增强法检测 Hg2+?摘 要 基于Hg??2＋?与胸腺嘧啶 （T） 形成“T?Hg??2＋??T”结构的原理建立了一种简单、灵敏的荧光增强法检测Hg??2＋?的方法。两条部分互补的富含T碱基的ssDNA在常温下分别以单链状态存在。当加入Hg??2＋?，由于?T?Hg??2＋??T键的形成?，两条ssDNA形成DNA双螺旋结构，溶液中荧光分子溴化乙锭（EB）嵌入DNA双螺旋结构，EB荧光强度增强。考察了DNA序列及DNA与EB浓度比等因素对检测灵敏度的影响。在优化的条件下，EB荧光强度和Hg??2＋?浓度在1.0×10??－8?～9.0×10??－7? mol/L范围内呈线性关系，检出限为3.0 nmol/L。Ca??2＋?, Mg??2＋?等常见阳离子对Hg??2＋?的检测不产生干扰，方法具有良好的选择性 关键词 汞； 荧光； 脱氧核糖核酸； 溴化乙锭； T?Hg??2＋??T? 1 引 言? 汞是一种重要的环境污染物，具有致畸作用，可蓄积性毒物，有生物不可降解性??[1]?。汞的人为释放及其对生态系统功能和人类健康的影响受到广泛关注，因而其含量检测在环境、食品等领域具有重要意义??[2]?。常用的检测方法有原子吸收法??[3]?、原子荧光法??[4，5]?、高效液相色谱法??[6]?及电感耦合等离子体质谱法??[7]?等。这些方法具有灵敏度高，选择性好的特点。但是，此类方法所需仪器较为昂贵，在多数实验室中的推广应用受到限制。开发易于推广的检测方法，例如电化学法??[8]?、化学发光法??[9]?、荧光量子点法??[10]?等，逐渐为研究者们所重视。其中荧光法以其简单、灵敏等优点而广受关注。? 自从胸腺嘧啶（T）与Hg??2＋? 特异性结合形成“T?Hg??2＋??T”结构被发现以来??[11,12]?，利用富含T碱基的短链DNA实现Hg??2＋?特异性检测的研究逐渐成为研究热点??[13，14]?。此类检测方法大都利用Hg??2＋?诱导富含T碱基的单链DNA折叠或2个富含T碱基的单链形成双链，进而使单链DNA保护的纳米金失去保护在盐诱导下聚集，通过观察纳米金溶液颜色变化达到检测Hg??2＋?的目的??[15]?。此方法甚至可直接用肉眼观察颜色变化，是一种低成本、简便快捷的检测方法。但此类方法需要制备单链DNA保护的金纳米粒子，且在检测时需要较长的温育时间才能引起足够的单链DNA折叠成双链DNA??[16]?。在荧光分析中，Ono等??[17]?利用分子信标的原理，设计了一种猝灭型的Hg??2＋?荧光传感器。加入Hg??2＋?后，T?Hg??2＋??T介导的发卡结构的形成，将相应荧光基团与猝灭基团拉近，二者之间发生荧光能量转移，导致荧光信号的猝灭，从而实现Hg??2＋?的检测，检出限为40 nmol/L。Liu等??[18]?通过在UO?2??2＋? 特异性DNA酶的茎部序列中引入T?T错配，设计了高灵敏的增强型汞离子荧光传感器。Hg??2＋?诱导的构象改变以提高DNA酶的活性来检测Hg??2＋?，其检出限为2.4 nmol/L。为避免污染离子UO?2??2＋?的影响，该小组??[19]?又设计了一种利用构象改变、替代反应的一种增强型离子荧光传感器，提高了检测灵敏度。Chiang等??[20]?利用ToTo?3嵌入剂，设计了一种无需对DNA进行荧光标记的Hg??2＋?荧光传感器，灵敏度也能达到同等水平。在此基础上，Ren等??[21]?利用共扼聚合物扩增荧光信号，将检出限降到0.27 nmol/L。? 本研究利用T与Hg??2＋? 形成“T?Hg??2＋??T”结构的特点，设计了两条部分互补的富含T碱基的单链DNA。原理如图1所示。在室温下，由于存在多个T?T错配，两条部分互补的单链DNA无法形成双螺旋结构。溶液中的荧光染色剂溴化乙啶（EB）自由分散在溶液中，表现出弱的荧光。加入Hg??2＋?后，由于T?Hg??2＋??T键的形成诱导溶液中单链DNA形成双螺旋结构，EB嵌入双链DNA因而荧光强度明显增强，据此建立了一种荧光增强型检测Hg??2＋?的方法。? ? 2 实验部分? 2.1 仪器与试剂 ? UV?2400PC紫外可见分光光度计（日本岛津公司，配DNA解旋温度分析系统）；F?7000 荧光仪（日本日立公司，配恒温附件装置）； PCR仪（东胜创新MIR序列）； ZYJ?Ⅱ冷原子荧光光度计（杭州大吉光电仪器公司）。? DNA（上海生工生物工程技术服务有限公司）。二甲基砷酸钠（Sodium cacodylate，Alfa Aesar）；溴化乙啶（EB，国药集团）；Hg（NO?3）?2（国药基团）。实验用水均为高纯水（≥18.2Ω