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猪瘟病毒C株cDNA构建 生命科学学院2000级 田萌 摘要 猪瘟是感染猪的一种急性传染病，猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)为引起猪瘟的致病原。CSFV是单股正链RNA病毒，属黄病毒科、瘟病毒属。本实验通过RT-PCR技术，分段克隆了弱毒株C株，将全长分为7部分，并利用一系列限制性内切酶，将7各片段和低拷贝质粒pMC-18连接在一起，得到猪瘟病毒C株的cDNA全长，为下一步疫苗的研究奠定基础。 一．研究背景： 猪瘟（Hog Cholera，或Classical Swine Fever）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,CSFV 或称Hog Cholera Virus）的感染引起的一种猪的急性传染病。其症状主要有内脏器官多发性出血、梗塞和坏死，死亡率甚高，是造成畜牧业重大经济损失的主要传染病。 猪瘟病毒在分类学上属于黄病毒科（Flavividae））））isease Virus,BDV）））5’ 3‘ 图1.1 CSFV的基因组结构图 全长cDNA在RNA病毒研究中的作用 由于DNA重组技术在分子水平上的应用，使得人们在分子水平上对基因组进行分析和修饰成为可能，从而为更深入的了解基因的结构与功能提供了重要的手段。而由于病毒的基因组相对较小，现代分子生物学实验技术在病毒学研究上的应用更是十分广泛。由于病毒仅仅是一段核酸和少量的几种蛋白质组成的介于生命物质和无生命物质之间的一种存在形式，所以获得病毒的基因组DNA和RNA病毒的全长cDNA就使得人们研究生命过程的工作变得更加主动。而由于除逆转录病毒外的RNA病毒在其生命周期中没有DNA的阶段，又由于RNA分子本身的不稳定性，及该病毒本身滴度较低和难以分离的特点，所以全长cDNA对于这种RNA病毒的研究就显得更加重要。 猪瘟的防治和疫苗研究 控制病毒病得最好方法是研制疫苗，人类的一些病毒性疾病如天花、麻疹和小儿麻痹症等疾病都是通过得以消灭。对于CSFV而言，在病毒疫苗的研制过程中，由于CSFV在组织培养细胞中的产量比较低，病毒囊膜脆弱，单位体积中的有效抗原含量较低，这样将CSFV灭活后制成的灭活疫苗免疫效力比较低，因此，长期以来，CSFV弱毒株一直是常规疫苗生产中实用而有效的疫苗来源。目前世界上已经被广泛应用的良好猪瘟弱毒疫苗有：我国培育的猪瘟兔化弱毒疫苗（C株），法国的低温细胞弱毒疫苗Thiverval株以及日本的低温细胞弱毒疫苗GPE-株，这些疫苗的使用为防治猪瘟病毒起了十分重要的贡献。 二．实验材料和方法 【材料和试剂】 PK-15细胞， 由本室保存； C株疫苗购自中国兽药监察所； 细胞培养用胎牛血清、细胞培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM）、胰蛋白酶购于Gibco BRL 公司； 克隆所用的质粒pGEM-T，X-gal，IPTG ,RNA提取试剂Trizol, 酚氯仿，异丙醇购于Promega公，pBluescript II SK(+) 购于Stratagene 公司；低拷贝质粒pMC-18为P. McMinn博士（澳大利亚悉尼医学院）惠赠；所用基因工程菌E.coli DH5?由本室保存； 逆转录酶Superscript II AMV，dNTP Mixture为Gibco BRL公司产品；PCR 高保真Ex-Taq和T4-DNA连接酶为Takara公司 F1: GTATACGAGGTTAGTTCATTC R1: CTATCTCATCGGTTGACGAT F2: GCATTCCTCATCTGCTTGAT R2: CCCAATCTTCACTTCCTTA F3: ACTGCAGTGGTAACGAGATG R3: CCATTTCTGTCAAGTCTGT F4: GTGACACTATGGGCCGGAC R4: GTCACAGTGTCCATTGTC F5: CAAATGCTATCAAGACGGAG R5: TCACCCTGTAGTTCCGTGAAC F6: GAGAACTGAGACTCTTGGAGG R6: CCAGTCTTGTTTTTGCTTCAG F7: ACAATCTGAAAAAAGGTAG R7: GCGGCCGCGGGCCGTTAGAAATTACC 引物在六合通和赛百胜公司合成，并用无菌超纯水溶解成100pmol/ml , 并稀释为50分之一浓度放－20℃保存。 [实验方法] 病毒的扩增收集和分段cDNA的获得： RNA的提取： 将104 TCID50ml的CSFV感染PK-1