家畜配子与胚胎生物工程.ppt

家畜配子与胚胎生物工程 胚胎移植 家畜胚胎移植概论 胚胎移植的概念及基本操作过程 胚胎移植在畜牧生产上的意义 胚胎移植的生理学基础和原则 生理学基础 胚胎移植的基本原则 胚胎移植的技术程序 供体母畜和受体母畜的选择 超数排卵 供体母畜的配种 胚胎的收集（手术法、非手术法） 胚胎的评定(正常胚胎、形态异常胚胎) 胚胎的保存和培养 胚胎冷冻、移植 具体操作 体外受精技术 体外受精 卵母细胞的采集和成熟培养 体外受精过程 精子的处理 受精方法 影响体外受精效果的因素 胚胎培养 克隆与核移植 胚胎分割 胚胎分割 胚胎分割的方法 分割胚的发育 影响分割胚发育的因素 胚胎分割技术的应用 核 移 植 核移植 供体细胞的准备 受核细胞的准备和去核 去核 移核 细胞融合 活化处理 化学激活 电激活 重组胚移植 转基因动物技术 转基因动物技术 转基因动物技术的发展简史 转基因动物技术的应用与前景 转基因动物技术存在的问题 建立转基因动物的方法 转基因动物的检测 性别鉴定与性别控制 性别鉴定与性别控制 性别鉴定 细胞遗传学方法 H-Y抗原测定法 SRY-PCR法性别鉴定 性别控制 免疫分离精子法 用流式细胞分类仪分离精子 本章结束！ 影响卵母细胞体外成熟的因素 动物的种类不同； 卵母细胞类型； 卵泡直径与卵母细胞体外成熟能力有关； 卵母细胞离体操作的时间和条件； 采卵季节有关； 精子的预处理 浮游程序（swim up） 玻璃棉过滤程序 BSA/Percoll 密度梯度 透明质酸的作用 精子洗涤 精子浓度 精子活力的提高 咖啡因 PHE 腺苷及其类似物 血小板激活因子 谷胱甘肽 己酮可可碱和茶碱 体外获能处理方法 肝素处理 高离子强度液处理 高pH 值处理 黄嘌呤 咖啡因处理 牛卵泡液 猪卵泡液 子宫液、输卵管液 精子活力激动剂 钙离子载体处理 徒手分割法 免疫手术法 胚胎分割的时期 胚胎的分割程度 透明带的有无 分割胚的培养条件 胚胎性别 移人受体的胚胎数 分割胚的保存 胚细胞核移植 构建异源重构胚胎 研究遗传-环境相互作用 产生嵌合体 产前诊断 提高体外受精的妊娠率 7%乙醇 离子霉素 A23187 6-DMAP Staurosporine SrCl2 显微注射法 胚胎干细胞法 反转录病毒载体法 精子载体法 胚胎移植(1) 胚胎移植(2) 胚胎移植(3) 胚胎移植(4) 胚胎移植(5) 胚胎移植(6) 胚胎移植(7) 胚胎移植(8) 胚胎移植(9) 胚胎移植(10) 胚胎移植(11) 胚胎移植(12) 胚胎移植(13) 胚胎移植(14) 胚胎移植(15) 胚胎移植(16) 胚胎移植(17) 胚胎移植(18) 胚胎移植(19) DNA的制备及其对转基因效率的影响 酶解、分离与抽提、氯化铯离心 收集DNA溶液、透析与定量 缓冲液的配制 受精卵的获取 显微注射 注射卵的移植 输卵管移植、子宫移植 胚胎干细胞的培养 ES细胞的基因组操作 ES细胞的子宫转移 反转录病毒的增殖与整合 反转录病毒载体的构建 反转录病毒的感染与导入 精子对外源DNA摄取 精子与外源DNA作用方法 混合培养法 电穿孔法 脂质体介导法 精子与外源DNA结合部位 影响精子与DNA结合的因素 基因组DNA的提取 目的基因的整合检测 外源基因整合位点的检测 斑点印迹(spot blot)法 Southern印迹(Southern blot)法 聚合酶链反应(PCR) 染色体原位杂交(in situ hybridization)法 转录水平的检测 Northern印迹(Northern blot)法 反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)法 RNase保护分析 蛋白质水平的检测 免疫印迹(Western blot)法 其它方法 胚胎细胞毒性分析 间接免疫荧光分析法 囊胚形成抑制法 免疫亲和柱层析法 H-Y抗血清直接输入法 免疫磁珠技术 发育阻滞现象 体外培养体系 合成液培养系统 共同培养系统 方法之一：解剖显微镜下观察卵丘细胞是否扩展松散, 扩展好的，一般认为是已成熟的卵母细胞。 方法之二：是用吸管吹打法或透明质酸酶分解法除去卵 丘细胞，以观察在卵周隙中是否有第一极体，但要 观察第Ⅱ次减数分裂(MⅡ)中期的核，需制片染色。 方法之三：采集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵 丘卵母细胞复合体。任何方法采集的COC都要求卵 母细胞形态规则，细胞质均匀，外围有多层卵丘细 胞紧密包围(图示1、图示2）。 基础培养液以合成培养液如TCMl99应用最多。缓冲体系以Hepes 或碳酸氢盐缓冲系(Earle’s Salts)为好，而磷酸盐缓冲系 (Hank’s) 较差。培养条件是5％CO2、95％空气饱和湿度，多 采用微滴法(100μL,