不同冻存时间对兔角膜内皮细胞活性的影响.pdfVIP

江西医学院学报2007年第47卷第6期 ActaAcademiae Medicin 璺 !! ! !! ‘49。 不同冻存时间对兔角膜内皮细胞活性的影响 戴志芳，黄艳琴，袁 铿，袁 芳，胡银英 (江西省医学科学研究所肿瘤研究室，南昌330006) 摘要 目的 探讨适合角膜内皮细胞(corneal endothelial cell，CEC)超低温冷藏保存的最佳期限。方法 将CEC 经一196℃液氮冷冻保存。在冷冻后1、6、12、24个月分别复苏，培养。观察CEC的生长情况和细胞存活率及24 h 贴壁率。结果 冻存 1、6、12个月复苏的CEC细胞存活率均≥80．0 ，冻存 24个月的CEC细胞存活率(72．0 ) 较前三个时间段稍有下降但没有差异；冻存 1、6、12个月CEC 24 h贴壁率均≥72．5 ，此三个时间段比较没有明显 差异，冻存24个月 CEC 24 h贴壁率(59．2 )与前三个时间段比较有统计学差异(PC0，05)。结论 在供体来源 短缺，细胞需要长期保存的情况下，深度冷藏是保存CEC的一种较好的方法。 关键词：角膜内皮细胞；冻存时间；活性；动物，实验；兔 中图分类号：R-332 文献标识码：A 文章编号：1000—2294(2007)06—0049—02 角膜内皮细胞(corneal endothelial cell，CEC) 1．3 方法 培养作为角膜基础与临床研究的重要技术方法，已 1．3．1 CEC制备及培养 广泛应用于角膜病理生理学、药理毒理学、免疫学、 将角膜内皮置含有 1 000 u／mI 青霉素， 分子生物学以及角膜内皮移植研究口 ]。近年来，随 1 000 U／mL链霉素的D-Hank’S液中浸泡10 rain。 着研究的深入，对CEC超低温冷藏、复苏以及体外 用D-Hank’S液清洗两遍后，内皮面朝上置24孑L培 培养技术越来越受到人们的关注，成为CEC研究中 养板中。每孑L加入1 mL 0．05 胰酶一0．01 EDTA 的一项重要课题。但是在CEC培养中存在着供源 (用D-Hanks液配制)置室温30 rain。镜下观察，细 紧缺，细胞因传代过度而发生变异或死亡。本实验 胞圆缩，间隙增大，加入等体积完全培养基(含1O 通过将CEC超低温保存，减少细胞传代培养次数， FCS的RPMI 1640培养液)中止消化，并反复轻轻 可避免上述情况发生。同时，在实验所需细胞的情 吹打，使CEC与组织分离。收集液体于离心管中， 况下，随时复苏后用于体外再培养 ]。因此，作者 1 000 r／min，离心10 rain，弃上清。用含2O FCS 将兔角膜内皮细胞经一196℃液氮冷冻保存后再复 的RPMI 1640培养液重悬沉淀成均匀细胞悬液。 苏培养，观察细胞生长情况、生物活性，以期确定合 置培养瓶中，37℃ 5 CO 培养箱中培养 48～ 理、最佳的冷冻保存期限。 72 h，待细胞融合，长满瓶底，进行传代。 1．3．2 CEC的冻存 1 材料与方法 取第2代生长旺盛、呈对数生长期的细胞用 1．1 试剂与仪器 0．25 胰酶消化，加入完全培养基中止消化，离心。 胰蛋白酶(购自美国DIFCO公司)、RPMI 1640 调整细胞密度至1．0×10 ／mL悬于冻存液(含10 (购自GIBCO公司)、新生牛血清(FCS，购自杭州四 DMSO+90 FCS)中。经程序降温后，于一196℃ 季青生物有限公司)、二甲基亚砜(DMSO，上海试剂 液氮冻存。 一 厂)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA，购自广东西陇化