以EGFP为报告基因的增强子鉴定质粒载体的构建及鉴定.pdfVIP

· 1834· 南方医科大学学报(J South Med Univ) 2007；2 12) 以EGFP为报告基因的增强子鉴定质粒载体的构建及鉴定 石秦东1,2张蓬勃 -一，康前雁 ，一，陈新林 ，田玉梅 ，刘建新 ，刘 勇 (西安交通大学医学院 神经生物学研究 所， 第一附属医院中心ICU，陕西 西安 710061； 第二附属医院麻醉科，陕西 西安 710004) 摘要：目的 构建以EGFP为报告基因的增强子鉴定质粒载体，并对其进行鉴定。方法 以pEGFP-NI质粒为模板，PCR法 扩增获得EGFP基因片段，并将其亚克隆入PGL3-promoter质粒骨架，得到以EGFP为报告基因的增强子鉴定质粒 pEGFP-enhancer。人工合成不同拷贝的缺氧反应元件(HRE)增强子序列，插入到pEGFP．enhancer多克隆位点获得重组 质粒pEGFP．HRE、pEGFP．5HR，以脂质体Lipofectamine 2000转染Hela细胞，常氧与缺氧处理后以荧光显微镜及流式 细胞仪观察EGFP荧光表达。结果构建的不同拷贝HRE的增强子鉴定质粒pEGFP．HRE、pEGFP．5HRE转染Hela细胞 后，常氧处理绿色荧光表达无差异，缺氧处理后随HRE拷贝数增加绿色荧光表达强度增加。结论成功构建了增强子表 达质粒pEGFP-enhancer，通过EGFP的表达强度可以反应增强子活性。 关键词：增强子；绿色荧光蛋白；载体；缺氧反应元件；Hela细胞 中图分类号：R394_3 文献标识码：A 文章编号：1673-4254(2007)12．1834．04 Construction and identification of a plasmid with EGFP reporter gene for enhancer function analysis SHI Qin-dong ·2 ZHANG Peng-bo ，’，KANG Qian-yan‘· ，CHEN Xin·lin ，TIAN Yu·mei ，LIU Jian-xin 。LIU Yong Research Center for Neuroscience， Key Laboratory of Environment and Genes Related to Diseases of Ministry of Education。，Central ICU，First Affiliated HospitaF,Xi’an Jiaotong University College of Medicine，xi’an 710061，China；’Department of Anesthesiology, Second Affiliated Hospital，Xi’an Jiaotong University College ofMedicine，Xi’an 710004，China Abstract：Objective To construct a plasmid vector with EGFP reporter gene for functionaI analysis ofenhancers．Methods EGFP DNA was amplified by PCR from plasmid PEGFP-Nl DNA and subcloned into plasmid PGL3．promoter backbone without IUC+gene to construct the enhancer-identifying vector pEGFP—enhancer．Different copies of hypoxia response element (aRE)sequence were synthetized and subcloned into the multiple cloning site of the plasmid pEGFP·enhancer．Using “p0fectamine 2000， the recombined pEGFP．HRE and PEGFP．5HRE plasmids were transfected into the Hela cells respectively． Alter hypoxic or normoxic ce