FMN结合蛋白在拟南芥突变体筛选中的应用.pdfVIP

THE APPLICATION OF FMN BINDING PROTEINS IN ARABIDOPSIS MUTANTS SCREENING A Dissertation Submitted to The Graduate School of Henan University In Partial Fulfillment of the Requirements For the Degree of Master of Science By Huang Yanqin Supervisor: Prof. Song Chunpeng and Dr. Zhang Yu May, 2015 摘 要 正常植物体的生命过程中，需要各种环境因子都处于非常适宜的状态。如果这些环 境因子有一种缺失，可能会影响植物的生长和发育。当各种环境因子处于正常的情况下， 植物体才能茁壮生长，完成生命周期。但是在自然界中这种非常适宜植物正常生长的环 境状态是相当少的。在植物的生长过程中，可能会受到一些外界环境压力的影响。 活性氧（Reactive oxide species, ROS ）是一系列氧化应激反应中的重要信号分子。 在植物体内，活性氧与种子萌发、生长发育、衰老以及光响应有很大关系。当植物受到 外界胁迫刺激时，体内会产生大量活性氧。如果过量活性氧不能及时清除，生物体自身 的氧化还原平衡将会被打破。目前已经有一些荧光探针可以用来检测生物体内的氧化还 原状态。 向光素的N 端有两个LOV 功能域，它们是与光、氧和电压相关的，并且上面都有 一个FMN 结合位点。光诱导半胱氨酸与FMN 的C(4a)结合形成加合物，但是这种加合 物在黑暗环境中会被降解。本课题主要对LOV 功能域的C/A （FMN 结合蛋白）突变体 进行研究，当C/A 突变体处于氧化态时，大量失电子，有荧光；当处于还原态时，大量 得电子，没有荧光。首先构建FMN 结合蛋白（下文中我们将其命名为FBP1.0 ）大肠杆 菌表达载体，通过在大肠杆菌体内对FBP1.0 蛋白进行诱导表达，不同浓度H O 和DTT 2 2 处理，发现随着H O 浓度的升高，FBP1.0 蛋白荧光逐渐增强；随着DTT 浓度的升高， 2 2 FBP1.0 蛋白荧光变弱至消失，说明FBP1.0 蛋白对氧化还原比较敏感，会出现氧化还原 状态的变化，并且随着光照时间的延长，FBP1.0 蛋白荧光逐渐变弱，说明光照得电子大 量被还原。又对FBP1.0 蛋白进行光谱学分析，发现FBP1.0 有表达且会和FMN 结合； 488 nm 光激发，发现在520 nm 处有吸收。 为了进一步研究FBP1.0 的功能，我们又构建FBP1.0 转植物超表达载体并转入模式 生物拟南芥，获得转基因植株，通过 qPCR 发现FBP1.0 在超表达拟南芥体内有表达， 且相对表达量是野生型的3 倍。为了筛选一些ROS 相关的突变体，进行EMS 诱变，进 行初筛条件的确定，不同处理条件下观测拟南芥根部荧光情况，结果发现0.5 mM H O 2 2 适宜处理进行突变体筛选，对M2 代初步筛选到7 棵潜在突变体。 I 关键词：ROS ，FMN 结合蛋白，荧光，EMS 诱变，筛选 II ABSTRACT