第二章 4 固定化酶与固定化细胞.pptVIP

固定化酶与固定化细胞 第一节 概述 一、什么是固定化酶？ 二． 固定化酶的优缺点 多次使用 可以连续反应 优点： 多酶反应 提高产物质量 应用范围广 缺点： 首次投入成本高、易使酶失活 大分子底物较困难 三、固定化酶研究历史 从50年代开始，1953年，采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与酶结合，制成固定化酶。 60年代后期，固定化技术迅速发展。1969年，日本首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶。 1971年，召开第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为Immobilized enzyme. 1973年，出现固定化菌体，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体。 70年代出现了固定化细胞技术。1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精，1978年，日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶。 1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸。 一．选择方法依据： （1） 酶的性质 :活性中心;必需基团;酶的 高级结构 （2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择 二． 酶的固定化方法 （一） 吸附法 （二）结合法 （三）交联法 （四） 包埋法（entrapping method） (五）热处理法 （一） 吸附法 1． 物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。  选择载体的原则 （1）要有巨大的比表面积 （2） 要有活泼的表面（3）便于装柱进行连续反应。 操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体廉价易得，而且可以反复使用。 由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。 （二）结合法 1 离子键结合法 2 共价键结合法☆ 1 离子键结合法 常用载体:纤维素， 葡聚糖凝胶 使用注意：pH、离子强度、温度 2 共价键结合法 （ 1 ）可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键 （ 2 ）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体 共价键结合法制备固定化酶的“通式” 首先载体上引进活泼基团 关键 然后活化该活泼基团 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键 （3）载体活化的方法 A．重氮法 B．叠氮法 C．烷基化反应法 D．溴化氰法 A．重氮法 反应示意式如下 B 叠氮法 对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于酶偶联 C．烷基化反应法 含羟基的载体可用三氯等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。 D．溴化氰法 本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。 D．溴化氰法 （三）交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。往往与其他方法连用 （四） 包埋法（entrapping method） 定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。 （四） 包埋法 包埋法分为网格型和微囊型 1．网格型 2．微囊型 1．网格型 (1) 概念 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法 2．微囊型包埋法 是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。 各类固定化方法的特点比较: 固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞 ，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。 细胞固定化方法 直接固定法 吸附法 包埋法 举例海藻酸钙包埋法 称取一定量的海藻酸钠配成水溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀，然后用注射器或滴管将冷悬液滴入一定浓度的凝固浴中（常用CaCl2 溶液），形成球状固定化细胞 人工种子 用人工种皮包被植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的