染色体规模化改造.pptx

田 平 芳 博士 副教授;Strategies for maximizing desired metabolite; 同源重组在胞内修改DNA，是基因功能研究的主要策略。 传统同源重组方法—— RecA重组系统有很多不足：需要较长的靶基因同源臂，重组率很低。 1998年，Murphy首次报道利用λ噬菌体Red重组系统在大肠杆菌染色体上进行基因替换，将 λ噬菌体的重组功能基因 exo，bet，gam在多拷贝质粒上表达，用于野生型 E.coli宿主菌的基因替换。 近年来，Red重组以其较短的同源臂和较高的重组效率等优点广泛用于基因组改造。 ; Exo 蛋白是核酸外切酶，从DNA双链的 5’到3’端降解DNA , 产生3’粘性末端。 Beta 蛋白是退火蛋白，结合到3’粘性末端,防止 被单链核酸酶降解，介导互补单链 DNA的退火。Beta 蛋白在 同源重组中起关键作用。 Gam蛋白阻止RecBCD降解外源双链DNA。 ;Reference;MAGE;MAGE技术原理图，在一套可以实时监控细胞浓度且无菌环境，将合成的Oligos通过瞬时高压转化至宿主菌株，并可以自动循环整个转化过程。;;MMR;AR: Allelic-replacement 在mutS（错配修复基因）缺失情况下，同源替换频率明显升高，并且在不同碱基错配类型上重组率均明显升高。;为解决该问题，MAGE技术发明人Harris H. Wang 2011年采用化学修饰的Oligos碱基，来减少错配修复机制缺失时的不需要的背景突变。结果显示，背景突变率下降100倍之多。参考文献： Wang HH, et al., Modified bases enable high-efficiency oligonucleotide-mediated allelic replacement via mismatch repair evasion. Nucleic Acids Res, 2011, 1-12;四种化学修饰碱基;;CAGE;CAGE;Frequency map of oligo-mediated TAG::TAA codon replacements and genetic marker integrations across the E. coli genome at each replacement position;TRMR; 通过合成带有分子条码的编码相关突变的插入序列，电击转化宿主细胞，然后利用分子条码技术追踪到相关突变，量化突变率，进行遗传性状定位。;TAG4 microarray results showing the distribution of synDNA oligos and alleles plotted by genomic location on the circular E. coli genome.（up library down library） inner circles, the concentration of each unique synDNA oligo before recombineering; outer circles, efficiency of generating each allele, calculated by dividing allele concentration by synDNA concentration. RecA→Red →MAGE → MMR →CAGE →TRMR;References;启示,我们怎么做？;启示,我们怎么做？;谢 谢！ 欢迎提问