电泳技术生化实验.ppt

Electrophoresis Theory ,Methods and Aplications 电泳的概念 电泳是指荷电的胶体颗粒在电场中的移动。 电泳技术的高度特异性，使混合物可以进行电泳分析。甚至结晶纯化的样品也可在电泳分析中分出两条带或更多的电泳带。 电泳方法的温和性，对不稳定的生物大分子的分离纯化有时比其它分离技术如沉淀法、离心、层析等更为方便，可靠，甚至可作为具有一定规模的制备方法. 第一节 基本原理 生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的 H＋浓度或与其它大分子的相互作用。在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即称为电泳。 影响电泳速度的相关因素 F＝E· q V= 带电颗粒在电场中泳动的速度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒的半径和介质粘度成反比。 电场强度 E 愈高，带电颗粒的泳动速度愈快，反之亦然。 溶液的 PH 偏离分子的等电点愈远，觧离度愈大，净电荷愈多，泳动速度越快。离子强度加大，电流加大，泳动速度加快。 14.电渗：支持物周围的离子层在电场作用下移动。是支持物本身所带的电荷吸附溶液中性质相反的离子，在电场中移动的结果。其带电愈高，电渗力愈大。 生物大分子迁移的方式 分子的尺寸大小和形状； 分子带电荷的性质与量； 分子的生物学与化学特性。 界面移动电泳: 在界面移动电泳仪的中间漏斗装上待测溶胶，U型管上端装电极，底部两个活塞的内径与管径相同。 实验开始时，打开活塞，使溶胶进入U型管，使两壁液面等高。接通电源，小心打开活塞，观察液面 的变化。根据通电时间和液面升高或下降的刻度，计算电泳速度。若是无色溶胶，用紫外吸收或其它光学方法读出液面的变化， 区带电泳: 区带电泳是将惰性的固体或凝胶作支持物，在其上面进行电泳，而将电泳速度不同的各组成分离。区带电泳实验简便易行，分离效率高，样品用量少，是分析和分离蛋白质的基本方法。 用滤纸作为载体的称为纸上电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳等.各组分即以不同速度沿载体运动，经一 段时间后，形成距起点不同距离的区带，区带等于样品中的组分数。再用适当方法，进行分析。 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE (Polyacryamide gel electrophoresis) 一.原理 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法。 由于其分辨率高，不仅能分离含有各种大分子混合物，而且可以研究生物大分子的特性；如电荷、分子量、等电点及分子构型。 聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个优点； A：可以在天然状态分离生物大分子； B:可以分析蛋白质与别的生物分子的混合物； C:电泳分离后仍然保持生物活性。 1.聚丙烯酰胺凝胶的合成 2.聚丙烯酰胺的聚合及影响因素 ① 化学聚合：以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲级乙二胺（TEMED）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生连锁反应形成网状的聚合物。 丙稀酰胺由过硫酸铵（AP）在碱性条件下产生游离氧自由基引发单体丙稀酰胺成为自由基状态而成的。在碱性 PH 时，反应速率迅速；而在酸性条件时，同样浓度溶液，聚合速率减慢。 在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且重复性差，在25 ℃聚合的凝胶则较透明和有弹性。 分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合，O2使过硫酸铵（AP）分解。故在做胶后常要用水进行封闭； 金属离子也干扰凝胶的化学聚合。 ②光聚合：以核黄素为催化剂在少量的氧存在下,分解成无色的还原型，在少量的O2条件下，还原型的核黄素氧化成有游离基的黄素环，聚合反应发生。 用量少，不会对样品有任何不良的干扰现象；故常用于样品胶的聚合； 聚合的时间可以自由控制 缺点：光照的量不容易掌握，重现性不太好； 光聚合适合大孔径凝胶的聚合，化学聚合适合各种凝胶的聚合。 3.聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径和分子筛效应 凝胶是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介质，能起到防止对流，把扩散减到最小，而且能影响大分子颗粒的移动过程。 大分子在凝胶中的分离是受其电荷、尺寸、和形状因素的影响． 凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力（Size sieving capacity），故将此现象称为分子筛效应（Molecular sieving effect）. 有效孔径取决于凝胶的总浓度 T％，孔径随着 T% 的增加而减小。 甲基双丙稀酰胺的浓度为5%时，有效孔径最小；T= 5%时，甲基双丙稀酰胺的浓度为5%时，孔径为20nm。 T是凝胶溶质的总百分浓度，C是与总浓度相关的交联百分浓度。故T是决定C，分离物的分子量的大小又决定了T的浓度。 二.仪器的进展 电泳槽是凝胶电泳的核心部分，所以变化主要是电泳槽的变革。 三.不连续凝胶电泳（d