基因工程主要知识点整理.docx

第一章基因克隆基因工程的基本技术有哪些？答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。构建基因文库一般使用什么作为载体？答：一般使用大肠杆菌作为载体克隆与亚克隆？答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。PCR对基因克隆有什么作用？答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。第二章分子克隆工具酶限制与修饰系统？答：限制系统可以排除外来DNA。限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。并且能够保证自身的DNA不被降解。使用最广泛的限制酶？答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶限制性内切酶的命名？答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。如：HindIII限制与修饰系统分类？答：至少可分为3类。II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。其限制反应与甲基化反应是分开的反应。不需要ATP的参与。限制酶识别的序列长度？结构？答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列限制酶产生的末端？答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端什么是同裂酶？分类？答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。但他们的切割位点有可能不同。分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？答：什么是同尾酶？答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。酶切的缓冲液中一般含有什么？作用是？答：调控pH的缓冲剂：稳定溶液的pHM：稳定酶的作用，提高酶的活性，提高酶的特异性DDT（二硫苏糖醇）：防止DNA二聚化，影响酶切结果BSA（小牛血清蛋白）：防止了酶的贴壁效应（可使酶变形），同时减少非特异性吸附，对酶有稳定和促进的作用。酶切的反应温度？反应时间？中止酶切的方法?答：反应温度大多为37℃，时间一般为2-3h。中止的方法是在65℃下反应20min。什么星星活性？抑制其发生的办法？答：在极端非标准条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特性称为星星活性。抑制星星活性的措施有很多，如减少酶的用量（可避免过分酶切）、减少甘油浓度、保证反应体系中唔有机溶剂或乙醇、提高离子强度到100-150mmol/L（如果不会抑制酶活性的话）和降低反应pH至pH7.0以及保证使用M作为2价阳离子。影响酶活性的因素有？答：可分为内因和外因外因是可预见的，可控的：反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应提及的选择以及反应时间的长短等。内因有：星星活性、底物甲基化和底物构象（线性还是超螺旋）原核细胞有几种DNA聚合酶？其特点是什么？答：DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或者双链DNA的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。DNA聚合酶I的三种活性?答：4、置换反应，若体系中只含有一种dNTP，那么会一直重复3过程，直至漏出与该dNTP互补的碱基。总之在没有dNTP的情况下，外切酶活性占主导地位，而当存在足够的dNTP时，外切活性和合成活性将处在平衡状态中，结果使得双链DNA称为平末端。切口平移法是什么？答：切口平移法是作为DNA聚合酶I 的一个应用，Klenow DNA 聚合酶是什么？有什么特征？有什么应用？答：Klenow DNA聚合酶是DNA聚合酶I去掉了5’-3’外切酶活性的一种聚合酶。但其3’-5’端的外切酶活性保留。因此应用更为广泛：T4噬菌体DNA聚合酶是怎么得到的？有什么活性？应用？答：来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌。其活性与KlenowDNA聚合酶相似，但是其3’-5’端外切核酸酶活性要强200倍。且不从单链模板上置换引物，应用：耐热DNA聚合酶有那些？特征是？作用？答：耐热DNA聚合酶是指在高温下具有活性的DNA聚合酶，来自噬高温的细菌，主要用于PCR反应。有TaqDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等等。DNA连接酶和DNA聚合酶作用方法相同吗？应用相同吗？答：作用方法都是催化磷酸二酯键的形成，但DNA连接酶是连接两个DNA片段，可以是环状DNA可以是单链DNA，而DNA聚合酶是作用一个一