RNA干扰技术抑制EC109细胞survivi.docVIP

　　RNA干扰技术抑制EC109细胞survivi 【摘要】 目的：应用RNA干扰技术（RNAi）研究针对survivin基因的siRNA，抑制survivin基因的表达并诱导食管癌细胞系EC109细胞的凋亡. 方法：构建针对survivin的siRNA表达质粒，转染至EC109细胞，荧光显微镜判断转染效率，蛋白质印迹和半定量RTPCR检测survivin蛋白表达及基因转录水平的变化，并在不同时间点收集转染细胞，利用流式细胞术及基因组DNA凋亡检测试剂盒，观察siRNA抑制survivin基因表达后诱导细胞凋亡的情况. 结果：荧光显微镜结果表明，重组质粒转染效率达46.70％. 半定量RTPCR检测到pSIREN/S质粒在EC109细胞内对survivin基因的转录抑制率为74.04%；蛋白质印迹结果表明，转染重组质粒pSIREN/S的EC109细胞survivin蛋白表达量仅为正常组的41.64%，而对照质粒pSIREN/对survivin基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用. 经pSIREN/S转染的EC109细胞基因组DNA出现明显的DNA ladder，流式细胞仪分析结果也显示凋亡细胞为60.78%. 结论：survivin特异性siRNA可明显抑制survivin基因的转录和表达，并能有效地诱导EC109细胞的凋亡，为下一步在体内利用pSIREN/S重组质粒沉寂survivin基因，促肿瘤细胞的凋亡提供实验基础. 【关键词】 RNA干扰技术 食管肿瘤 survivin基因 EC109细胞 　　0引言 　　潮汕地区是中国六大食管癌高发区之一，据统计，广东省南澳县恶性肿瘤死因构成的排位顺序为食管癌最高，占恶性肿瘤死亡总数的半数以上［1］. 因此对于食管癌特别是中晚期患者，寻找有效的治疗手段至关重要. survivin是IAP（inhibite apoptosis protein）家族成员之一，具有抑制凋亡的作用；同时也是细胞周期调节蛋白，通过干扰细胞的有丝分裂以调节细胞的凋亡［2］. 已有文献［3-5］报道，食管癌患者的肿瘤组织中survivin 的表达明显高于正常组织，我们利用siRNA技术，以食管癌EC109细胞株为模型，利用survivin特异性siRNA，对survivin基因的转录、表达及其诱导EC109细胞凋亡进行了研究. 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　人食管鳞癌细胞株EC109为汕大医学院沈忠英教授馈赠. 大肠杆菌DH5α及RNAi载体质粒RNAiReadypSIRENDNRDsRedExpression购自Invitrogen公司. RPMI1640、小牛血清、胰蛋白酶等购自Sigma公司. 脂质体Lipofectamine2000购自Invitrogen公司. 兔抗人survivin单抗购自Santa Cruze，CY3标记的羊抗兔IgGFc抗体购自武汉博士德公司. 限制性核酸内切酶EcoR I，BamH I等购自NEB公司. T4 DNA连接酶、DL 2000标准Marker由TaKaRa公司提供. 质粒提取试剂盒购自上海博光生物技术有限公司. RNaeasy Kit购自Qiagen公司. 　　1.2方法 　　1.2.1抑survivin siRNA序列及载体构建 　　根据survivin的编码序列及以往的研究资料，结合siRNA序列设计原则并利用Blast进行查询，确定其为特异性survivin RNA干扰的靶序列, 其正义链: 5′ gat cca aag cat tcg ggt tgc ttc aag acg gca acc gga cga atg ctt ttt ttt tga att ca 3′, 反义链: 3′ agc ttg aat tca aaa aaa aag cat tcg tcc ggt tgc cgt ctt caa gca acc gga cga atg ctt tg 5′. 为排除siRNA本身的影响，我们设计了无关的siRNA序列，序列，即正义链为：5′gat ccg act tca taa ggc gca tgc ttc aag acg gca tgc gcc tta tga agt ctt ttt tgt cga ca3′，反义链为：3′gct gaa gta ttc cgc gta cga agt tct gcc gta cgc gga ata ctt cag aaa aaa cag ctg ttc ga5′. 所有的寡核苷酸片段均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成. 退火后分别插入经BamH I和EcoR I线性化的载体pSIREN中，构建重组载体pSIREN/S和pSIREN/. 转化大