SARSCoV N蛋白和MAP19的相互作用.docVIP

　　SARSCoV N蛋白和MAP19的相互作用 【摘要】 目的: 研究SARSCoV N蛋白与MAP19之间的相互作用。方法: 利用免疫共沉淀试验验证SARSCoV N蛋白与MAP19的相互作用, 并利用AP19表达量的影响。结果: SARSCoV N蛋白与MAP19能够在细胞内相互作用, 且SARSCoV N能够显著提高MAP19的表达量。结论: SARSCoV N蛋白与MAP19能够在细胞内形成复合物, 将为进一步研究SARSCoV N蛋白与MAP19相互作用的生物学功能提供实验基础。 【关键词】 SARSCoV N; MAP19; 相互作用 　　[Abstract] AIM: Severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARSCoV) is the etiological agent of SARS, an emerging disease characterized by atypical pneumonia. Using a yeast tatic protein of MASP(mannanassociated serine protease). The interaction betonstrated by immuno coprecipitation, and the amount of MAP19 influenced by SARSCoV N onstrated by immunocoprecipitation. SARSCoV N greatly increased the amount of MAP19. CONCLUSION: SARSCoV N can bind ay be conductive to further research into the molecular mechanism of action betL/L胎牛血清和100 U/mL青霉素、 100 U/mL链霉素的DMEM(Invitrogen公司产品)在CO2含量为50 mL/L的37℃孵箱中培养, 采用消化法进行细胞传代。 　　1.2 质粒构建 N基因 (GenBank accession number AY274119) 从患者血清的SARSCoV RNA 通过RTPCR获得, (带EcoR I的上游引物, 5′CGGAATTCCATGTCTGATAATGGACCC3′; 带BamH I的下游引物5′GCGGATCCTTATGCCTGAGTTGAATC3′)。扩增产物用PCR纯化试剂盒(Promega)进行纯化, 随后用EcoR I和BamH I酶切, 然后与经过同样酶切的pEGFPC1载体 (Clontech)连接, 转化, 测序。随后, N基因被克隆到pcDNA 3Flag载体 (Invitrogen), 构建了pcDNA 3FlagN表达质粒。 　　MAP19基因片段缺失了5′端22～56 bp的DNA序列, 我们采取的策略是利用PCR反应补全缺失的片段。 　　补全MAP19基因片段所用引物: Pf1(49 bp～89 bp) (带BamH I的上游引物)5′CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGCCTTC3′; Pf2(35 bp～99 bp)5′CCCTCCTGGGCCTTCTGTGTGGCTCGGTGGCCACCCCCTTGGGCCCGAAGTGGCCG 　　GAACCTGTG3′; Pr(带EcoR I的下游引物): 5′CGGAATTCCTAGAGGCTCTGCTCTG3′。 　　1.3 细胞培养与转染 细胞转染采用Vigoras Lipofect(Invitrogen, Inc.)转染试剂, 严格按照转染试剂说明书进行操作。以Φ100 mm的培养皿为例, 当培养皿中的细胞生长至覆盖60%～80%皿底面积时进行转染。转染前1 h将旧的培养基吸出, 加入4 mL含100 mL/L胎牛血清的DMEM完全培养基。然后配制质粒DNA脂质体混合物: 将10 μg质粒DNA(单一质粒或两种以上共转染质粒)与4 μL脂质体分别用200 μL的150 mmol/L的NaCl稀释。室温放置5 min后, 将两者混合, 轻微吹打混匀后室温放置15 min, 使DNA与脂质体形成复合物。取出待转染细胞, 向培养皿中加入400 μL的质粒DNA脂质体混合物, 轻轻摇动培养皿, 使DNA脂质体复合物均匀分布在培养皿中。在孵箱中培养6～8 h后, 将含有脂质体的培养基吸出, 加入10 mL 含血清和抗生素的完全培养基继续培养。换液36 h后收集细胞。 　　1.4 免疫共沉淀 细胞转染36～