羊膜培养液体外抑制兔角膜上皮细胞血管内皮生长因子.docVIP

　　羊膜培养液体外抑制兔角膜上皮细胞血管内皮生长因子 【摘要】 　　目的：探讨羊膜培养液对角膜上皮细胞中血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial grom培养皿及自制的羊膜培养皿上。实验分为4组，Ⅰ组(对照组)：无血清的DMEM培养液，Ⅱ组：去上皮的羊膜培养液，Ⅲ组：未去上皮的羊膜培养液，Ⅳ组：将细胞直接接种于无上皮羊膜。作用48h后用Trizol法提取各组样本的总RNA,进行RTPCR一步法反应检测各组VEGF mRNA表达并与βactin比较。结果：正常角膜上皮细胞中有VEGF基因表达，在Ⅲ，Ⅳ组中表达受到明显抑制（P＜0.01，n=5）。结论：羊膜培养液明显抑制VEGF mRNA在角膜上皮细胞中的表达。 【关键词】 羊膜；角膜新生血管；血管内皮生长因子；角膜上皮细胞 　　Abstract　AIM: To detect the suppression effects of culture supernatant of human amniotic membrane on the expression of vascular endothelial groal RCE cells niotic membrane (Ⅳ group) cultures respectively. Then one of plastic group (Ⅱ group) an amniotic membrane edium; another plastic group (Ⅲ group) an amniotic membrane edium; the other t FBS ponents ).After 48 hours, the total RNAs of these cultures RNA from Ⅰ group and Ⅱ group, hoan amniotic membrane edium) and Ⅳ group (RCE cultered directly on naked amniotic membrane) （P＜0.01, n=5）.CONCLUSION: Amniotic membrane transplantation is partly through depressing the mRNA expression of VEGF in corneal cells to reduce the corneal neovascularization of injuried corneal surface. And it may be an efficient method of curing corneal neovascularization in clinic.  　　KEYEM培养基+甘油（V/V，1∶1）混合液，80℃低温冰箱冷冻保存。使用时，将羊膜置于室温解冻,PBS液水化30min，用2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA混合液在37℃消化30min，用细胞刮刀轻轻刮除羊膜的上皮层后，用PBS液漂洗3次，剪成4cm×4cm大小备用。将35mm培养皿的底钻掉，消毒后备用。将剪好的去掉上皮的羊膜的基底面向上，包于35mm培养皿上,用手术缝线固定。将羊膜为底的培养皿置于60mm培养皿中，加入少量DMEM培养基（含有150mL/L胎牛血清），于CO2细胞培养恒温箱中过夜。取经无菌处理的新鲜羊膜，用2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA混合液在37℃消化30min。以细胞刮刀将羊膜的上皮层细胞成分刮掉，将去上皮成分的4cm×4cm大小羊膜3块浸泡于制备好的无血清DMEM细胞培养基30mL中。作用48h后取其上清液待用。取经无菌处理的新鲜羊膜，保留其上皮层，将4cm×4cm大小羊膜3块浸泡于制备好的无血清DMEM细胞培养基30mL中。作用48h后取其上清液待用。 　　1.2　方法 　　兔处死后，立即将眼球取出，共30眼。用加有双抗的生理盐水漂洗3次，用剪刀取下透明的角膜部分，浸于生理盐水中，漂洗1次。用手术刀片去掉角膜的内皮层，其余组织上皮面向上移入7.5cm玻璃平皿中，加入2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA的混合液，37℃下消化25min后，用刀片将角膜的上皮层轻轻刮下，离心收集上皮细胞接种到25mL培养瓶中，以含150mL/L FBS的DMEM培养基培养，2～3d换液1次。培养7d致形成融合性生长，用2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA的混合液消化后，分别传代接种于35mm培养皿和单纯去上皮羊膜为底物的培养皿组。用含150mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养传代细胞形成70%融合性生长后，将各组中的培养液换为无血清的DMEM培养液继续培养12h,以去