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氨基酸的测定方法—茚三酮柱后衍生法 北京市营养源研究所 叶颖慧 参考方法：GB/T 5009.124-2003 食品中氨基酸的测定 从各种生物体中发现的氨基酸有 180 多种，但参与蛋白质组成的常见氨基酸或称基本氨基酸有二十二 种。除脯氨酸外，这些氨基酸在结构上的共同点是与羧基相连的 α-碳原子上都有一个氨基，因而称 α-氨基 酸。结构通式如下： 1.适用范围 本方法适用于食品中蛋白质水解得到的天冬氨酸、苏氨酸等十六种氨基酸的测定；不适用于蛋白质含 量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食品中氨基酸测定。 2.原理 食物中的蛋白质经盐酸水解，成为游离氨基酸，再用氨基酸自动分析仪进行测定。 氨基酸分析仪是应用离子交换层析原理，离子交换柱树脂为磺酸型强阳性阳离子交换树脂。氨基酸与 树脂中的交换基团进行离子交换，用不同 PH 的缓冲溶液进行洗脱时，因交换能力的不同而将氨基酸混合 物分开，一般是酸性和含羟基的氨基酸最先被洗脱下来，然后是中性氨基酸，最后是碱性氨基酸。分离流 出色谱柱的氨基酸在 135℃下与茚三酮反应生成紫色物质茚二酮炔一茚二酮胺（DYDA ），通过分光光度 计测定其含量。其最低检出限为 3 pmol 。 （1）蛋白质水解原理 蛋白质是由氨基酸通过肽键首尾相连而成的共价多肽链。一分子氨基酸中的羧基与另一分子氨基酸分 子的氨基脱水而形成的酰胺叫做肽，其形成的酰胺键称为肽键。 R O R R O R - H O 2 NH2 CH C OH + NH2 CH COOH NH2 CH C NH CH COOH 肽键 蛋白质水解就是使蛋白质逐渐降成分子量越来越小的肽段，破坏肽键，直到最后成为氨基酸的混合物。 （2 ）氨基酸分离原理 氨基酸是两性电解质，在水中既起酸（质子供体）的作用，也起碱（质子受体）的作用。 氨基酸在溶液中的存在形式： 氨基酸分离： （2 ）氨基酸与茚三酮反应原理 3.试剂 除注明外全部试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。 （1）6 mol/L （0.5%巯基乙酸）盐酸溶液：优级浓盐酸与水以体积 1 比 1 混合，加入巯基乙酸 5 mL 混匀。 （2 ）0.02 mol/L 的盐酸溶液：吸取 1 mL 的 6 mol/L 盐酸溶液，加入 300 mL 的蒸馏水，混匀即可。 （3 ）BRIJ-35 溶液：25 g 溶于 100 mL 蒸馏水中。 （4 ）缓冲溶液：（参考日立L-8900 氨基酸自动分析仪） R ○ 三菱化学公司生产的 MCI L-8500 系列缓冲溶液，或根据下表配制缓冲溶液 名称 PH-1 PH-2 PH-3 PH-4 PH-RG 容器 B1 B2 B3 B4 B6 钠浓度 N 0.16 0.20 0.20 1.20 0.20 密度 1.02 1.02 1.02 1.06 1.00 1 蒸馏水（约） mL 700 700 700 700 700 2 柠檬酸钠（二水） g 6.19 7.74 13.31 26.67