高铁饮食致C57BL-6小鼠黑质DA多巴胺能神经元选择性损伤的研究 .docVIP

　　高铁饮食致C57BL/6小鼠黑质DA多巴胺能神经元选择性损伤的研究 ：吕占云 姜宏 徐华敏 谢俊霞 【摘要】 目的 研究高铁饮食对C57BL/6小鼠黑质(SN)和中脑腹侧被盖区(VTA)多巴胺能神经元的不同损伤。方法 将C57BL/6小鼠随机分为高铁饮食组和正常对照组，利用免疫组织化学染色法及铁染色技术检测两组小鼠SN和VTA的酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数及铁水平的变化。结果 高铁饮食组SN的TH阳性细胞数较正常对照组明显减少(t=16.31，Plt;0.001)，铁染色阳性细胞数较对照组明显增高(t=13.01,Plt;0.001)。而两组小鼠VTA的TH阳性细胞数及铁染色阳性细胞数均无明显差别。结论 铁在SN的选择性聚积参与了SN多巴胺能神经元的选择性损伤。 【关键词】 铁;黑质;腹侧被盖区;神经元;创伤和损伤;酪氨酸单氧化酶;小鼠 [ABSTRACT] Objective To investigate the effect of ferric diet on the degeneration of dopaminergic neurons betental area (VTA) in C57BL/6 mice. Methods The male C57BL/6 mice ly divided into tal?diet group. Tyrosine hydroxylase (TH) positive cells and iron positive cells in SN and VTA ined using immunohistochemistry and iron staining. Results pared ber of TH?positive cells in SN ber of iron?positive cells significantly increased (t=13.01,Plt;0.001) in ferric?diet group. The numbers of both TH?positive cells and iron?positive cells ulation in SN is involved in the selective degeneration of dopamine neurons in SN. 　　[KEY PTP)处理的小鼠模型以及鱼藤酮处理的灵长类动物模型等[2]。其机制可能与不同多巴胺能神经通路对氧化应激的反应不同，以及其脑源性神经营养因子(BDNF)基因的表达不同有关[2]。但其确切机制仍然不是十分清楚。本实验采用高铁饮食饲养小鼠方法，观察了SN和VTA的酪氨酸羟化酶(TH)和铁水平的变化，以探讨SN多巴胺能神经元的选择性损伤及其机制。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 实验动物 C57BL/6雄性小鼠16只,15～17 d龄，由北京维通利华实验动物中心提供。 　　1.1.2 试剂 右旋糖酐铁(美国Sigma公司)、鼠抗兔TH抗体(美国Sigma公司)、免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物工程有限公司)，其余试剂购自本地代理商。 　　1.2 方法 　　1.2.1 实验动物模型的建立 将16只小鼠编号后根据随机数字表随机分为2组，每组8只。高铁饮食组每日给予含质量分数0.025的右旋糖酐铁饮食，自由取食至出生后2个月;正常对照组每日正常饮食至出生后2个月。 　　1.2.2 组织准备 用80 g/L水合氯醛按4 mL/kg腹腔注射麻醉动物，灌注固定取材，脑组织采用40 g/L多聚甲醛固定24 h，然后置200 g/L蔗糖冷冻保护溶液中，待脑组织沉底后再移入300 g/L蔗糖冷冻保护溶液中，行连续冠状冰冻切片，片厚为16 μm，载玻片预先用多聚赖氨酸处理，烤箱烤干后保存。 　　1.2.3 免疫组织化学染色 切片在空气中放置至室温后，用0.01 mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗3次，浸泡在体积分数为0.01的H2O2?甲醇溶液中孵育30 min以除去内源性过氧化物酶。PBS冲洗3次后用体积分数0.015正常山羊血清37 ℃封闭30 min，用TH抗体(1∶5 000)孵育，并置于湿盒中于4 ℃冰箱内过夜。PBS冲洗后，用生物素化山羊抗鼠二抗工作液孵育30 min，PBS冲洗3次，用辣根酶标记的链酶卵白素工作液孵育30 min，PBS冲洗3次，用DAB试剂盒显色2 min，观察其反应。不加一抗的切片不显色[3]。 　　1.2.4 铁染色 组织切片处理同TH免疫组化染色，采用PBS冲洗3次后，将切片置于等量体积分数0.02的盐酸和20 g/L亚铁氰化钾的混合液中孵育30 min，PBS冲洗后浸泡在体积分数为0.01