人抑瘤素m 在大肠杆菌中的表达、纯化及其对 - 中国医药生物技术.pdf

中国医药生物技术 2015 年6 月第10 卷第3 期 Chin Med Biotechnol, June 2015, Vol. 10, No. 3 203 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.003 ·论著· 人抑瘤素M 在大肠杆菌中的表达、纯化 及其对胆固醇代谢关键基因表达的影响 杜郁* * ，贾晓健，袁芳，王丽，王丽非，洪斌 【摘要】 表达产生。OSM 同 IL-6 、IL-11 和白血病抑制因 目的 构建人抑瘤素 M （OSM ）的原核表达载体，通过表 子（leukemia inhibitory factor，LIF ）等细胞因子都 达及纯化获得重组蛋白，为深入研究 OSM 的功能及机制 属于糖蛋白 130 （glycoprotein 130 ，gp130 ）细胞因 奠定基础。 子家族，该家族成员的生物活性具有多样化的特 方法 利用 PCR 技术，从质粒 pOTB7-hOSM 中扩增出人 点，在细胞分化、增殖，血细胞生成，免疫调节， OSM 蛋白编码序列，与原核表达载体 pET-16b 连接，构 炎症应答和协调细胞因子间功能等方面发挥着广 建表达质粒 pET16b-OSM 。在 BL21(DE3) 工程菌中表达目 泛而重要的作用[1] 。体外研究发现 OSM 不仅能调 的蛋白，Western blot 法检测 OSM 蛋白的表达。为提高 控多种肿瘤细胞生长。而且，OSM 在脂质代谢和 OSM 的可溶性表达，采用共表达分子伴侣的方法提高其上 心血管病研究领域也具有显著活性，Liu 等[2]发现 清产物的表达量。将放大发酵的产物处理后，经镍亲和层析 OSM 能诱导 HepG2 细胞中低密度脂蛋白受体 法纯化，获得 OSM 成熟蛋白，SDS电泳分析蛋白 （low-density lipoprotein receptor，LDLR ）的表达， 纯度。MTT 法检测 OSM 对 A375 细胞的抑制活性，实时 并且显著降低高脂高胆固醇饮食地鼠的血浆总胆 荧光定量 PCR 试验分析 OSM 对 HepG2 细胞中胆固醇 固醇、低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯的水平[3] 。 代谢相关基因（LDLR 、ABCA1 、ApoA-I 和 SR-BI ）表达 Pöling 等[4]报道 OSM 通过诱导心肌细胞去分化， 的影响。 刺激心脏重构，在心肌梗死过程中发挥保护效应。 上述这些结果提示 OSM 在心血管疾病的研究中 结果 成功构建 pET16b-OSM 原核表达质粒，酶切鉴定和 具有重要的价值。 测序分析与预期结果完全一致。在 E. coli BL21(DE3) 中实 人 OSM 的相对分子量约为 28 kD ，其成熟肽 现了目的蛋白的表达，通过共表达分子伴侣质粒 pTf16 ，进 一步提高了可溶性表达的水平。放大发酵产物经镍亲和层析 由 196 个氨基酸组成，是一个耐热、耐酸的单链 纯化获得 OSM 成熟肽，电泳检测纯度大于 98% 。MTT 法 糖蛋白。尽管 OSM 的成熟肽包含有两个 N-糖基 检测所制备的 OSM 蛋白抑制 A375 细胞生长的 EC50 为 化位点，但是尚无研究显示糖基化修饰与 OSM 的 体外生物学活性相关，因此，本工作根据 OSM 成 315 ng/ml 。mRNA 水平检测证实 OSM 能剂量依赖地上调 胆固醇代谢相关的低密度脂蛋白受体和 ABCA1 基因的表 熟肽的序列，采用高效的宿主系