第七章 工业微生物原生质体育种和原生质体融合.ppt

第七章 工业微生物原生质体育种和原生质体融合育种 第一节 原生质体育种 一、原生质体再生育种 出发菌株的选择→菌种活化和与培养→原生 质体制备→原生质体再生→高产菌株分离→ 复筛→遗传性状鉴定→菌种特性和发酵特性 研究 二、原生质体诱变育种 菌种活化和与培养→原生质体制备→原生质 体悬浮液稀释至一定浓度，取一定放入无菌 平皿中→ 紫外灯下诱变处理→ 置暗处后处 理→ 再生培养→高产菌株分离→复筛→遗传 性状鉴定→菌种特性和发酵特性研究 三、原生质体转化育种 菌种活化和与培养→ 原生质体制备→离心洗 涤，取原生质体悬浮液1ml，2倍SMM浓缩液和 质粒DNA各0.1ml，然后加入40%聚乙二醇 4000ml，混匀后静置2min,离心，悬浮于 1mlHCP培养几种，适当稀释后分离在选择培 养基上，双层平板培养，筛选转化子。 第二节 微生物原生质体融合育种 一、定义与意义 细胞融合（Cell fusion）也叫细胞杂交是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。 由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术在创造新细胞、培育新品种方面意义重大，也被广泛应用于细胞生物学和医学研究的相关领域。 基因型相同的细胞融合成的融合细胞称为同核 体，来自不同基因型的融合细胞则称为异核体。 从融合效果上，细胞融合包括： 对称融合：即两个完整的细胞间的融合。 不对称融合：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再与另外一个完整的细胞进行融合。 二 、发展历史 细胞融合现象最初是在动物细胞中表现的。 1858年发现正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞情况。 1875年观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生的合并现象。 1962年日本学者发现一种叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。 20世纪七十年代初，华裔加籍科学家高国楠发现聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合，开拓了植物细胞融合的研究。 细胞融合技术逐步扩展到植物细胞和微生物细胞伴随者细胞融合技术的成熟。 20世纪80年代，真正意义上的细胞工程诞生了，细胞融合现已成为细胞工程的核心技术之一。 三、原生质体融合育种的特点 1)杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。 2)受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。 3)遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。 4)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。 5)有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。 6)提高菌株产量的潜力较大。 7)有助于建立工业微生物转化体系。 四、细胞融合过程 融合过程中细胞膜变化 类脂质分子发生扰动和重排 导致细胞桥的形成 细胞质、核相互融合 五、原生质体融合技术 原生质体制备 原生质体纯化 原生质体融合 融合子检出 融合子鉴定 （一）微生物原生质体制备 1、定义及特点 定义：去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生 质体。 特点：无细胞壁，可以方便地进行遗传操 作、人工诱变、细胞器转移、细胞融合等操 作。 具有全能性，能再生细胞壁。 2、微生物细胞壁组成 微生物种类不同其细胞壁结构和化学组成不同，酶解处理的有效酶也不一样，因此要求根据微生物种类特性选择合适的酶。 G+:糖肽、低聚糖、多糖、蛋白质、磷壁酸、糖醛酸磷壁酸 G-：糖肽、磷壁酸、蛋白质、类脂、脂多糖、脂蛋白、二氨基庚二酸、甘氨酸、阿拉伯糖、半乳糖 真核细胞壁组成 种类 纤维素 几丁质 其他多糖 疫霉属 25 0 65 毛霉属 0 9 44 酵母属 0 1 60 镰刀霉属 0 39 29 裂褶菌数 0 5 81 鬼伞属 0 33 50 3、制备原生质体的酶类 自然界中多种生物都能合成破坏降解菌体细胞壁的酶，如蛋 清中的溶菌酶，蜗牛消化酶，寄生性微生物合成酶。 包括： 纤维素酶 酵母裂解酶 几丁质酶 商品酶： Novozyme234来自Trichoderma harzianum Lywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶 Gglucuronidase葡聚糖甘酸酶 4、影响原生质体制备的因素 1)菌体的前处理 为了将菌作一些前处理使酶作用的效果好一些，