far-western blot分析cry2ab蛋白和小菜蛾中肠蛋白的相互作用 1.doc

2014-03-02 承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所 试验设计： 试验项目：protein-protein Docking 研究APN和Cry2Ab蛋白的相互作用 试验人员：许炼 试验负责：朱育菁、潘志针 报告日期：2014-03-02 计数月份：2014年月 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计，实施实验，记载，分析清晰，结论清晰文献完整，发表水平 福建省农业科学院农业生物资源研究所 农业微生物研究中心 电话: 0591 传真: 0591试验目的 同源模建又叫比较模建，是目前为止最为成功及实用的蛋白质结构预测方法。同一蛋白家族的成员往往具有类似的结构和功能，通过对已经测定的蛋白质的空间结构进行对比，发现蛋白质的三级结构比一级结构更保守，同源蛋白质之间具有相似的空间结构，同源蛋白质之间具有保守的结构内核，差异仅存在与分子表面的回折区。一般情况下，如果两个蛋白质的序列同源性不低于50%,那么这两个蛋白中90%的C原子均方根偏差(RMS)不会超过3，如果以结构叠合后的两个蛋白质分子等价C原子之间距离的均方根偏差为衡量标准，其RMS不会大于1A。而同源性低于50%的蛋白质分子之间的许多结构参数如CC原子均方根偏差(RMS)、残基溶液的可及性、侧链构象等的保守性都会减弱，但依然具有较强的相似性。甚至对于两个序列相似性为20%左右的远亲蛋白，在某些情况下，其等价的主链原子之间的RMS有时候依然可以在1.83.0A,相同折叠方式的区域有时候会超过整个蛋白分子的一半以上，因此，同源蛋白来预测蛋白质结构是比较可靠的。 分子对接思想的历史可以追溯到100年前Hsher提出的“锁钥模型”。随着人们对受体与配体结合认识的不断深入及计算机和计算科学的迅速发展，利用计算机模拟来研究受体配体相互作用的方法一分子对接方法应运而生。分子对接比锁和钥匙”模型复杂得多，该方法从已知两个分子的单体结构出发，找到它们之间的最佳结合模式PDBePISA预测对接后蛋白的相互作用位点。 试验方法利用SWISS MODEL 同源建模得到Cry2Ab和APN的PDB文件从Procheck、Verify_3D、ErratPDBePISA在线分析软件分析Cry2Ab和APN的相互作用，该网站通过氨基酸残基的ASA(accessable surface area)，BSA(accessable buried area)，△G来评价蛋白与蛋白的相互作用。 试验结果3.1 SWISS MODEL同源建模 图1a. Cry2Ab同源建模模板（Cry2Aa） 图1b.小菜蛾APN同源建模模板（ Human Aminopeptidase N） SWISS MODEL 模型搜索结果会出来若干个个同源性较高已知3D构象的蛋白，作为目标蛋白建模的模板，其中Cry2Ab我们选择同源性非常高的Cry2Aa同源性达到87.52%，而APN蛋白的模板则相对较少，我们选择同源性最高的人的APN蛋白作为模板进行建模。 图2a. Cry2Ab蛋白同源建模评价 图2b. APN蛋白同源建模评价 PROCHECK评价后，生成Ramachandran图，其中有9.8%的残基处于合理域大于高质模型90%的残基处于合理区域的阈值要求，说明模建结构氨基酸残基的二面角是比较合理的。ERRAT得分大于50的时候，表明模型原子之间的非键相互作用和C骨架的构象都是合理的，高质量的模型，而模型的得分为，满足高质量模型的要求。VERIFY-3D主要考察模板和建模结构的相容性，若80%以上的残基的Compatibility Score值大于0.2，则表示此模型质量较高。而在中有%的残基满足Compatibility Score值大于0.2的要求。因此，经过PEROCHECK, ERRAT和VERIFY-3D的评价后，证明模型的构象是合理的、可靠的。 3.2 ZDOCK 进行分子对接 利用ZDOCK进行Cry2Ab与APN蛋白的对接，将同源建模得到的Cry2Ab蛋白和APN蛋白的PDB文件上传到ZDOCK网站，上传之前必须先对两个蛋白的chain进行重新命名，我们将Cry2Ab命名为chain A，APN为chain B。ZDOCK允许选择可能的结合位点(binding site)和非结合位点(block site)，若不选则进行全蛋白docking。我们选择全蛋白docking，结果出现10个得分最高的可能对接模型。我们发现这10个模型均是Cry2Ab蛋白的Domain II和APN进行结合(图3)，这个跟文献报道是相符的(DomainII为 Binding Domain，主要是跟中肠上的受体进行结合 )，说明我们的