免疫磁捕获、免疫细胞化学鉴定.pdf

人外周血循环肿瘤细胞检测试剂盒使用说明书 （免疫磁捕获、免疫细胞化学鉴定） 简介： 本试剂盒利用免疫磁球捕获肿瘤病人全血中极少量的循环肿瘤细胞 （CirculatingTumorCell，CTC），并通过免疫细胞化学鉴定所捕获的细胞，从而 实现对 CTC的灵敏检测。其中免疫磁球表面修饰有抗上皮细胞粘附分子 （EpCAM）抗体。免疫细胞化学鉴定是通过异硫氰酸荧光素标记的细胞角蛋白 抗体 （FITC-anti-CK19）、Alexa Fluor 594标记的抗白细胞共同抗原抗体 （AF594-anti-CD45）和DAPI对细胞进行免疫荧光染色，DAPI染色阳性，CK19 表达阳性，CD45表达阴性 （DAPI+/CK19+/CD45-）的细胞被鉴定为CTC。本试 剂盒对目标细胞的捕获效率高达90%，简便快速、特异性强、非常可靠，可以在 3小时内完成对全血中CTC的检测。 试剂盒所含试剂：（10人份/盒） 试剂标号 组分 用途 状态 规格 配制 试剂A 牛血清白蛋白 封闭 固体粉末 试剂B 免疫磁球 磁捕获 悬液 200μL 即用型 试剂C 4%多聚甲醛 固定细胞 液体 5mL 即用型 试剂D 1%TritonX-100 通透细胞 液体 5mL 即用型 试剂E DAPI 细胞染色 液体 50μL 即用型 试剂F FITC-anti-CK19 细胞染色 液体 20μL 即用型 试剂G AF594-anti-CD45 细胞染色 液体 50μL 即用型 试剂H 1×PBS 洗涤 液体 25mL 即用型 *保存条件：4-8℃ 用户自备试剂和材料： 1. 试剂L：通透封闭液 于0.05g 试剂A 中加入0.5mL试剂D溶解待用，或按照此用量比配置所需 用量的通透封闭液，标为 “试剂L”。 2. 试剂M：染色液 于0.01g试剂A中加入190μL试剂H溶解后，向其中加5μL的试剂E，2μL 的试剂F， 5μL试剂G，或按照此用量比配置所需用量的染色液，标为“试 剂M”，4℃避光保存待用。 4. 磁力架 （推荐Dynal公司123-20D） 5. 移液器 （吉尔森）、涡旋仪、超声波清洗器、进口耗材 （离心管、枪头等）、 恒温水浴摇床、荧光倒置显微镜等。 6. 96孔板或PDMS小槽 检测步骤： 1. 捕获 抽取约 1.5mL病人血液于EDTA抗凝真空采血管中，将全血样品转移到2 mL 的离心管内，加入20μL试剂B （试剂B预先用超声仪超声分散均匀）， 手摇或涡旋分散均匀后，置于恒温摇床上，150rpm，37℃下孵育30min。 2. 细胞固定 将步骤1中的样品置于磁力架上，吸引约5min，用移液器延外侧轻轻吸出清 液，再用400μL 的试剂C重悬样品，室温放置10min。 3. 细胞通透封闭 将步骤2中的样品于磁力架上，吸引约3min，用移液器去掉清液，再取400 μL 的试剂L重悬样品，室温放置20min。 4. 细胞染色 将步骤3 中的样品置于磁力架上，吸引约3min，用移液器去掉清液，再取 200μL的试剂M重悬样品，37℃避光孵育30min。待孵育结束后，将样品置 于磁力架上，吸引约3min，用移液器去掉清液；再用200μL的试剂H重悬， 再磁吸引，去掉清液，用试剂H重复洗涤3次，最后用100μL 的试剂H分 散样品。 5．检测 将步骤4得到的样品转移到96孔板底部或者PDMS小槽内，磁富集到底部 后用倒置荧光显微镜观察。 三通道同时观察并用CCD采集