《药学分子生物学》第十章 外源基因表达与基因工程药物.docVIP

外源基因表达与基因工程药物 *基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 *外源基因的表达：利用细胞内相关酶系及其调控系统，将外源基因转录成mRNA，进而翻译成肽链或加工活性蛋白质的过程，称之为基因的表达（简称表达）。 *基因工程药物：将生物体内生理活性物质的基因，利用重组DNA技术加以改造，然后使其在细菌、酵母、动物细胞中大量表达的新型药物。 为何要表达基因？难以获得；成本、产量、规模受限；无法合成 基因表达基本原理 Gene expression：转录+翻译+修饰。 转录模式：原核：全长转录。真核：先转录 再剪接 加工修饰 翻译模式：原核：转录与翻译偶联。真核：转录与翻译在不同的时间与空间分隔进行。 真核基因表达在原核生物与真核生物中的差别 原核生物的转录单位：一个转录单位可以包括一条以上的基因。 真核生物的转录单位：只含有编码一条肽链的信息。 原、真核生物mRNA结构特征比较 如何选择表达系统，根据外源蛋白的属性选择表达系统：目标蛋白是否是糖基化蛋白；真核生物蛋白三维结构的复杂程度。 基因表达基本类型 、根据宿主细胞不同：原核表达系统（prokaryotic expression system）：大肠杆菌、芽孢杆菌等；真核表达系统（eukaryotic expression system）：酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等 、根据表达产物在宿主细胞的部位：胞内（intracellular expression）；定位（specific expression）；分泌（secretory expression） 、根据表达产物的溶解状况：可溶性表达（soluble expression）；包涵体表达（inclusion body expression） 、根据表达产物的结构状况：非融合表达（non-fusion expression）；融合表达（fusion expression） 5）、转基因生物：转基因动物；转基因植物 外源基因表达基本过程一、目的基因的获得二、目的基因与表达载体的重组三、重组表达载体导入宿主细胞及其筛选与确认 *目的基因的获得：基因组DNA文库；cDNA文库；PCR法；化学合成法 基因组DNA文库*：组织细胞的全部DNA提纯，酶切，酶切片段均重组入同一类载体，得许多重组DNA分子，全部转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝，这样生长的全部细菌所携带的所有基因组DNA片段，即为整个基因组。 cDNA文库的概念：提取组织细胞的全部mRNA，以其为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的单链cDNA，再复制成双链cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。 PCR是一种模拟天然DNA复制的体外扩增DNA序列的技术，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。 人工合成，应用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 *基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源DNA而将目的DNA带入宿主细胞。 *载体的选择标准 能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多克隆位点（MCS）；分子量小，以容纳较大的外源DNA。 载体的分类（一）克隆载体（二）表达载体（三）穿梭载体 *克隆载体 (cloning vector)能使插入的外源DNA序列被复制、扩增而不能表达，这样的载体为克隆载体。 克隆载体的元件以及性质 1. Ori 能在受体细胞中复制，是复制起点（起始点） 2. Ampr 抗生素抗性基因可以便利加以检测 3. Mcs 多克隆位点，携带外源基因片段 表达型载体*：为使插入的外源DNA序列转录，进而翻译成多肽链而设计的载体称表达载体。表达型载体除具有克隆载体所具有的特性外还具备表达系统元件。 表达系统元件：原核表达系统元件；真核表达系统元件 原核表达载体的表达系统元件是启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。 P → Rbs/SDs → Mcs → terms 真核表达载体的表达系统元件是启动子/增强子-克隆位点-终止信号和poly(A)信号 P/E → Mcs → terms → 加poly（A）信号 E．Coli--哺乳动物细胞质粒表达载体 E．coli表达载体 哺乳动物细胞质粒表达载体 1. Ori 2.Ampr 3.Mcs 4. Promoter 5. SDs Rbs 6.Terms 7.可