黄芩中黄芩苷的正交提取工艺及体外抑菌活性研究 赵强 （甘肃工业 .doc

黄芩中黄芩苷的正交提取工艺及抑菌活性研究 赵强甘肃工业职业技术学院化工 摘要：采用正交提取法提取黄芩中黄芩苷，采用HPLC对提取物进行检测，以Cloversil C18色谱柱，乙腈-0.5 %甲酸溶液作为流动相进行梯度洗脱。柱温30℃，进样量5μL，流速0.6 mL/min，240-280 nm波长紫外检测。对大肠埃希氏杆菌和金黄色葡萄球菌进行体外最小抑制浓度（MIC）测定，并运用透射电子显微镜从超微结构探讨了黄芩苷对两种供试菌的作用机理。结果表明：其最佳正交提取工艺为A2B2C3，即乙醇浓度70%、乙醇体积100mL、冷浸时间36h；对大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC分别为：0.50 mg/mL和0.20 mg/mL；在透射电镜下观察到黄芩苷可改变细菌的细胞内、外膜的渗透性而使细胞膜破坏，并伴随大量内溶物（DNA 和mRNA）的溢出，从而起到抑菌作用。 关键词：黄芩苷；正交提取；体外抑菌 黄芩（Scutellaria baicalensis）为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi.）的干燥根，味苦、性寒。具有清热燥湿，泻火解毒，止血、安胎的功效[、6]。主治湿温、暑温胸闷呕恶、湿热痞满、泻痢、黄疸、肺热咳嗽、高温烦热、胎动不安等症。黄芩是祖国医学中常用中药，来源丰富、价廉。黄芩苷是黄芩的主要有效成份，本实验主要通过正交实验，探究出黄芩中黄芩苷提取的影响因素，优化实验设计，并将提取出的黄芩苷对供实菌进行抑菌实验，以为相关疾病的防治临床应用及开发天然抗菌药物提供一定的理论依据。 材料与方法 1.1材料 1.1.1药材 黄芩粉末（购买于甘肃省市药材站，经自然风干，粉碎）。 1.1.2仪器设备及药品 KQ-500D型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公式产品）RE52-99?旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂产品）、ZDP-2120型电热培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司产品）、UV-9200型紫外-可见光分光光度计（北京瑞利仪器分析有限公司产品）、AB104-S型精密电子分析天平（瑞士梅特勤公司产品）索氏提取器（昆山市超声仪器有限公司产品）、Agilent 1100 Series型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）可变波长紫外检测器（VWD）、色谱工作站为CAG Bootp Serier、色谱柱为Cloversil C18柱（4.6 mm×150mm，5μm）、0.45μm针式过滤器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。95%乙醇、甲醇、黄芩苷标准品、乙腈、甲酸、三重蒸馏水等，其余试剂均为国产或进口分析纯。 1.1.培养基及菌种 牛肉膏蛋白胨培养基，按规定方法配制，分装灭菌备用。大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli，ATCC35216）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC26111）为工程实验室保存标准菌株。 1.2方法 1.2.1样品的制备 精密称取黄芩粗粉10g，按表1的L9(33)正交实验提取条件冷浸超声波震荡后，转入索氏提取器中，回流加热提取，旋转蒸发器减压至干，然后把提取的黄芩苷溶解在70%甲醇中进行HPLC分析。 1.2.2色谱条件 利用高效液相色谱法测定黄芩中黄芩苷含量色谱柱：Cloversil C18柱(4.6 mm×150mm，5μm)，检测波长240-280 nm，柱温30℃，进样量5μL，流速0.6 mL/min，流动相V(乙腈)∶V(甲酸) =99.5∶0.5。 1.2.3抑菌实验 实验所用37℃培养过夜，挑选典型菌落接种于液体培养基中，经37℃培养24h，将从黄芩中提取的黄芩苷进行倍比稀释，制备系列浓度稀释液。然后用无菌吸管将稀释液分别定量加入到无菌培养皿中，与定量倒入的培养基充分混匀，制成含药液平板。再按培养皿上标的计量，用移液管分别吸取定量被试菌液，涂于平板上，培养一段时间后，以观测完全没有菌落生长的最低黄芩苷浓度作为该药物的最小抑菌浓度（MIC），以未加药品之平皿为空白对照[2、3]。1.2.4透射电子显微镜观察 将接种在琼脂蛋白胨培养基上，37℃培养24h后，用5mmol/L磷酸缓冲液pH=6.0）洗脱细菌，使其含量为108 CFU /mL。菌悬液500μ，加入到浓度为0.2%的黄芩苷溶液中溶于1% HAc，使黄芩苷最终浓度为0.1%。置于1.5mL锥形离心管中37℃摇床120 r/min）培养24h。离心取细菌沉渣。 取上述离心后的细菌团，加入3%戊二醛4℃前固定5h后，用5mol/L PBS缓冲液漂洗3次，每次10min，再用1%的OsO4 4℃后固定1h，接着再用5mol/L PBS漂洗3次。依次用70%、80%、90%、100%系列乙醇，4℃下脱水各10min，再用纯丙酮脱水2次，每次10mi